Autor(es):
Poças, Gonçalo Manuel Pinho Ribeiro de Oliveira 
Data: 2009
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/8767
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Biologia molecular; Stresse (Fisiologia); Drosofilas; Doença de Parkinson
Descrição
As doenças neurodegenerativas caracterizam-se por um aumento de morte
celular em populações neuronais específicas, que variam dependendo do tipo
de doença. A utilização de modelos animais constitui a forma mais eficaz de
estudar, in vivo, a patofisiologia destas doenças.
Utilizando Drosophila melanogaster, vulgarmente designada “mosca da fruta”,
como organismo modelo, pretendia-se demonstrar a relevância do stress do
retículo endoplasmático (RE) e da Unfolded Protein Response (UPR) no
processo de neurodegeneração. Para isso, foram estudados os mecanismos
de protecção vs morte celular induzidos pela via de sinalização Ire1/Xbp1 e
procurou-se identificar alvos genéticos desta via.
Neste estudo utilizou-se como ensaio o fenótipo do olho “glossy”, obtido pela
sobre-expressão de Xbp1spliced nas células do olho durante os estádios
larvares. Através de um screen genético e de análises microarray de DNA em
células sobre-expressando Xbp1spliced, foram identificados dois genes
candidatos a alvos genéticos da via Ire1/Xbp1: sac1 e ninaA. Demonstrou-se
que a forma mutada de sac1, contendo um p-element na região reguladora do
gene, provoca um agravamento deste fenótipo, aumentando os níveis de
neurodegeneração no olho do adulto. Este resultado constitui uma indicação
de que sac1 mutado poderá ser um “enhancer” deste fenótipo. No entanto, as
mutações pontuais de sac1, L2F e L16C, não causaram nenhum efeito
significativo sobre este fenótipo. Assim, mais estudos são necessários para
clarificar o papel de sac1 neste contexto de neurodegeneração. Relativamente
a NinaA, uma chaperone da rodopsina-1, demonstrou-se que a expressão de
ninaA é afectada pela via Ire1/Xbp1, uma vez, que em células mutantes de
Ire1 o nível de expressão deste gene diminuiu drasticamente.
Outra finalidade deste trabalho consistia no desenvolvimento de novos
modelos das doenças neurodegenerativas de Parkinson (DP) e Huntington
(DH) em Drosophila. Recorrendo a técnicas convencionais de clonagem
molecular, os cDNAs de proteínas associadas às DP e DH foram clonados em
pUAST, um vector de expressão em Drosophila. Procedeu-se à expressão
destas proteínas em células S2 de Drosophila, tendo sido demonstranda a
formação de agregados de proteínas, típicos destas patologias.
Simultaneamente foram geradas linhas transgénicas de Drosophila contendo
estes cDNAs e foram mapeados os locais de inserção resultantes do processo
de trangénese. Por fim, procedeu-se à expressão dirigida das proteínas de
interesse no olho de Drosophila e demontrou-se que a versão mutada da
proteína associada à DH, a huntingtina, induz a neurodegeneração da retina. Neurodegenerative diseases are characterized by an increase in cell death of
particular neuronal populations, specific to each illness. The use of animal
models constitutes the most powerful research tool to study the
pathophysiology of these diseases in vivo.
By using Drosophila melanogaster, generally known as the fruit-fly, as a model
organism, it was intended to demonstrate the significance of the endoplasmic
reticulum stress (RE) and of the Unfolded Protein Response (UPR) in the
process of neurodegeneration. In order to achieve it, the mechanisms of
protection vs. cell death through induction of the Ire1/Xbp1 signaling pathway
were investigated, along with the search for new genetic targets of this
pathway.
The “glossy” eye phenotype, obtained through the expression of Xbp1spliced in
the eye-cells while in larval stage was used as an assay in this work. Two
genes were identified as genetic targets of the Ire1/Xbp1 pathway by
performing a genetic screen and a DNA microarray analysis: the sac1 and the
ninaA genes. It was shown that sac1, a gene coding for a lipid phosphatase, in
its mutated form containing a p-element, causes an aggravation of the glossy
phenotype, increasing the level of neurodegeneration in the adult fly. Such
result indicates that the mutated sac1 might be an “enhancer” of this
phenotype. However, this result was not reproduced with the point mutations in
sac1, L2F and L16C. Therefore, more studies are required to clarify the role of
sac1 in this context of neurodegeneration. Regarding NinaA, a chaperone of
rodopsin-1, it was shown that the level of expression of ninaA was affected by
the Ire1/Xbp1 pathway, as it was drastically decreased in mutant cells for Ire1
gene.
The second aim of this work was to develop new models of neurodegenerative
diseases of Parkinson’s (PD) and Huntington’s (HD) in Drosophila. Using
conventional molecular cloning techniques, the cDNAs coding for relevant
proteins of PD and HD was subcloned to the pUAST plasmid, a Drosophila
vector. The expression of these relevant proteins in Drosophila S2 cells was
demonstrated to induce the formation of aggregates. Simultaneously,
Drosophila transgenic lines carrying the genes of interest were generated and
the insertion sites were mapped. Finally, we expressed the proteins of interest
specifically in the Drosophila eye and it was demonstrated that the mutant form
of the protein associated with HD, huntingtin, induces retinal
neurodegeneration. Mestrado em Biologia Molecular e Celular
