Author(s):
Encarnação, Marisa Alexandra Rego da 
Date: 2007
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/4376
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Métodos biomoleculares; Lisossomas; Doenças genéticas; Expressão genética; Genotipos; Fenotipos
Description
As doenças lisossomais de sobrecarga (DLS) são um grupo de doenças
hereditárias do metabolismo, caracterizadas pela deficiência em determinadas
vias catabólicas intralisossomais. A maioria das DLS envolve defeitos em
proteínas lisossomais solúveis que são endereçadas para o lisossoma pela via
da manose-6-fosfato (M6P). A síntese da M6P inicia-se com a transferência da
GlcNAc-1-fosfato para manoses específicas nas enzimas lisossomais recémsintetizadas,
este passo é catalizado pela enzima N-acetilglucosaminil-1-
fosfotransferase (GlcNAc-fosfotransferase). Após a aquisição da marcação
M6P, as enzimas lisossomais são reconhecidas por receptores que
direccionam o seu transporte até aos lisossomas.
Na ausência de actividade da GlcNAc-fosfotransferase, as enzimas
lisossomais são secretadas. Esta deficiência é conhecida por Mucolipidose tipo
II (ML II ou doença I-cell) uma doença autossómica recessiva caracterizada
por um atraso psicomotor muito grave e que leva à morte do doente na
primeira década de vida. A Mucolipidose tipo III (ML III ou polidistrofia pseudo-
Hurler) é uma doença menos grave em que a sobrevivência até à idade adulta
é possível. Na ML III a actividade da GlcNAc-fosfotransferase em vez de
ausente está diminuída. A GlcNAc-fosfotransferase é uma enzima hexamérica:
α2β2γ2, codificada por 2 genes diferentes. O gene que codifica a subunidade γ
(GNPTG) localiza-se no cromossoma 16. As subunidades α e β são
codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossoma 12, sendo
originadas após o processamento proteolítico do precursor α/β. Alterações no
gene GNPTAB podem originar a ML II ou a ML IIIA, enquanto que mutações
no gene GNPTG dão origem à ML IIIC, que ao nível das características
clínicas e bioquímicas não é distinguível da ML IIIA.
Este trabalho teve como principais objectivos: 1) a caracterização genotípica
de doentes portugueses com ML II e ML III para os genes GNPTAB e GNPTG;
2) a obtenção de dados acerca do espectro mutacional das ML II e ML III e da
sua distribuição em Portugal; 3) a implementação de estratégias de
diagnóstico molecular para estas patologias; 4) a avaliação da causalidade das
mutações encontradas no que respeita ao seu impacto ao nível do mRNA e
previsão dos seus efeitos na estrutura e função da proteína; 5) o
estabelecimento de uma correlação entre a presença de uma determinada
mutação nos genes GNPTAB e GNPTG e o fenótipo clínico.
Foram estudados dez doentes não consanguíneos (nove portugueses e um de
origem indiana) classificados clinicamente como ML II ou ML III. Nestes
doentes as mutações foram identificadas através de uma estratégia analítica
que englobou o estudo quer do cDNA quer do gDNA. Foram identificadas cinco mutações distintas no gene GNPTAB. Destas, três
mutações são novas (p.E667X, p.I403T e c.440delC) e duas estavam
previamente descritas na literatura (c.3503delTC e p.S399F). Foram também
encontradas duas mutações novas no gene GNPTG, a c.639delT e a c.610-
1G> T. Verificou-se que as mutações previamente descritas no gene GNPTAB
(S399F e 3503delTC) estão associadas, nos doentes estudados neste
trabalho, a fenótipos similares aos descritos em outros doentes que
apresentavam estas mutações. Na presença das mutações novas I403T,
E667X e 440delC (esta em homozigotia) os doentes apresentavam na
presença da primeira um fenótipo compatível com ML IIIA e no caso das
últimas duas um fenótipo característico de ML II. O doente com alterações no
gene GNPTG apresenta um fenótipo compatível com ML IIIC. Este estudo
permitiu também clarificar a classificação clínica inicial, o que levou ao
diagnóstico mais preciso do tipo de Mucolipidose.
A mutação 3503delTC constitui 50% dos alelos identificados nos doentes
portugueses. Uma vez que esta mutação já tinha sido descrita anteriormente
como sendo frequente em doentes de origem árabe, foi efectuada uma análise
haplotípica para esclarecer se a presença desta mutação em ambas as
populações se deve a um efeito fundador ou se, pelo contrário, resulta de
eventos mutacionais independentes. Os dados obtidos parecem indicar que
estamos na presença de um evento mutacional único e que, possivelmente, o
alelo mutante presente nos dois grupos de doentes tem uma origem comum.
Os estudos de expressão dos genes GNPTAB e GNPTG por qRT-PCR
mostraram a ocorrência de uma diminuição dos níveis de mRNA GNPTAB na
presença de mutações frameshift e nonsense no gene GNPTAB (440delC,
3503delTC e E667X). Nesta situação, a redução dos níveis de mRNA
GNPTAB, pode ser explicada pelo aparecimento prematuro de codões STOP o
que torna bastante provável que os transcritos sejam alvo do mecanismo
NMD. Na presença das mutações missense (S399F e I403T) a diminuição dos
níveis de mRNA GNPTAB não é significativa. O doente com alterações no
gene GNPTG (heterozigótico composto 610-1G>T/639delT) também
apresentava níveis de mRNA GNPTG bastante reduzidos relativamente ao
valor médio dos controlos.
Os resultados da análise mutacional efectuada constituem, até à data, os
únicos dados de caracterização molecular destas patologias na população
portuguesa contribuindo também, para um melhor conhecimento a nível
mundial das bases moleculares desta doença. Por outro lado, estes estudos
são extremamente importantes na medida em que a análise mutacional
permitirá a realização de um diagnóstico pré-natal molecular e um diagnóstico
mais preciso aos familiares de doentes recentemente diagnosticados. Lysosomal storage diseases (LSD) are a group of inherited metabolic diseases
characterised by the impairment of the intralysosomal catabolic pathways.
The majority of LSD involve defects in soluble lysosomal proteins that are
targeted to the lysosome by the mannose 6-phosphate (M6P) pathway. The
initial step in M6P synthesis is the transfer of GlcNAc-1-phosphate to selected
mannoses of newly synthesized lysosomal enzymes, which is catalysed by Nacetylglucosamine
1-phosphotransferase (GlcNAc-phosphotransferase).
Following acquisition of the M6P marker, lysosomal enzymes can be
recognized by specific receptors that target their transfer to lysosomes.
In the absence of GlcNAc-phosphotransferase activity lysosomal enzymes are
secreted from the cell. This defect is recognized as mucolipidosis II (ML II or Icell
disease) an autosomal recessive disease characterised by severe
psychomotor retardation often resulting in death in the first decade of life.
Another type of mucolipidosis, mucolipidosis III (ML III or pseudo-Hurler
polydystrophy) is a milder disease and survival into adulthood is possible. In
ML III GlcNAc-phosphotransferase activity is reduced rather than absent.
GlcNAc-phosphotransferase is a multimeric enzyme, α2β2γ2, encoded by two
genes. The gene for the γ subunit (GNPTG) is located on chromosome 16. The
α and the β subunit are encoded by the GNPTAB gene, which is located on
chromosome 12. Proteolytic processing of the α/β precursor generates the
individual α and β subunits. Defects in GNPTAB result in mucolipidosis II and
IIIA whereas mutations in GNPTG were only found in ML IIIC patients. ML IIIC
is biochemical and clinically indistinguishable from ML IIIA.
The main aims of the present work consisted in: 1) performing the molecular
characterisation of Portuguese patients with ML II and ML III for the GNTPAB
and GNPTG genes; 2) to obtain data about the mutational spectrum and the
frequency distribution of causative mutations in Portugal 3) the development of
a molecular diagnosis strategy; 4) the evaluation of the impact of novel
mutations at mRNA and the predition of its effects on protein structure and
function and 5) the establishment of a genotype-phenotype correlation.
We have studied ten nonconsanguineous patients (nine Portuguese and one of
Indian origin) with ML II or ML III. The mutations were identified by the study of
both cDNA and gDNA.
We have identified five different mutations in the GNPTAB gene. Two
mutations were previously described in the literature: S399F and c.3503delTC
and three are new mutations: c.440delT, I403T and E667X.
In the GNPTG gene we have found two novel mutations: c.610-1G>T and
c.639delT. Patients carrying mutations previously described in the GNPTAB
gene (S399F and 3503delTC) presented similar phenotypes to those manifested by other patients with the same mutations described elsewhere.
The present work enabled the establishment of a genotype-phenotype
correlation for the novel mutations, I403T, E667X and 440delC (this one in
homozygosity) showing that the first one seems to be associated with ML IIIA
and the last two with the more severe ML II. The patient with mutations in the
GNPTG gene (c.610-1G>T and c.639delT) presents a phenotype compatible
with ML IIIC. The results obtained in this study also led to the revision of the
initial clinical classification, some patients classified as ML II were after the
molecular analysis classified as ML III (A or C) and vice-versa.
An interesting result of our mutation analysis was that the most frequent
disease allele among the Portuguese patients - c.3503delTC, which was
harboured by 9 out the 18 mutant alleles (50%), was also the most common
among a group of patients of Arab-Muslin origin studied by Bargal et al. (2006).
This finding prompted us to perform a haplotypic analysis in order to address
the question of whether the mutation had a single origin or, contrarily, whether
it was a recurrent mutation. The results seem to indicate that in Portuguese and
Arab Muslim patients the c.3503delTC disease chromosomes share a common
origin.
As to the mRNA expression, the values obtained by relative quantification using
real time RT-PCR indicate that the presence of frameshift or nonsense
mutations in the GNPTAB gene (c.440delC, c.3503delTC and p.E667X) was
associated with a significant decrease in mRNA GNPTAB levels comparatively
to the median controls value. Since these substitutions results in the formation
of transcripts with premature termination codons, reduction in mRNA might
reasonably be explained by the transcripts involvement in the NMD pathway. In
the case of missense mutations (S399F and I403T) values of mRNA did not
significantly differ from the median controls value. On the other hand, in the
patient with alterations in the GNPTG gene (c.610-1G>T/c.639delT compound
heterozygote) the mRNA GNPTG levels were found to be significantly
decreased in comparison to the reference value.
The results obtained with this study constitute, until now, the only molecular
characterisation data of these pathologies in Portugal, contributing also to
extend the knowledge of ML II and ML III causing mutations worldwide.
Additionally, the strategies developed for mutation analysis, constitute valuable
tools that will allow carrier detection and prenatal molecular diagnosis, leading
to the improvement of genetic counselling with great benefits for the affected
families. Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
