Author(s):
Gouveia, Duarte Domingos 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/11360
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Bioquímica; Proteómica; Stresse oxidativo
Document details
Influência da oxidação da BSA na sua digestão proteolítica
Description
As modificações oxidativas em proteínas são processos comuns em organismos aeróbios. A compreensão dos processos envolvidos na iniciação e desenvolvimento destas modificações, assim como da sua natureza, poderá contribuir para a elucidação do processo de envelhecimento, assim como de algumas patologias a ele associadas. A análise de proteínas oxidadas é comummente feita com base em técnicas proteómicas de identificação e quantificação utilizando a espectrometria de massa. A identificação é feita normalmente utilizando a análise dos péptidos resultantes de digestões proteolíticas das proteínas. No entanto, existem muitas limitações impostas pelas modificações oxidativas na utilização destas técnicas. De entre elas, a digestão enzimática a que as proteínas são sujeitas antes da análise por MS, representa talvez a que necessita de mais atenção. A ocorrência de clivagens falhadas poderá levar à impossibilidade de efetuar identificações e quantificações eficazes. Neste trabalho pretendeu-se avaliar a influência que a oxidação da albumina do soro bovina (BSA) teria na sua digestão proteolítica. Para tal procedeu-se à oxidação da BSA recorrendo-se à reação de Fenton durante vários tempos de incubação. Analisou-se posteriormente o grau de oxidação avaliando as concentrações de proteína por SDS-PAGE, os níveis de carbonilos em solução por espectrofotometria e na banda da BSA por Western Blot. A eficiência da digestão proteolítica foi avaliada por espectrometria de massa com base nas taxas de cobertura obtidas em pesquisas dos espectros em bases de dados. No final, concluiu-se que a proteína sofre uma fragmentação crescente ao longo do processo de oxidação, em consonância com um aumento crescente dos níveis de carbonilos. Pela análise da eficiência da digestão, não se verificaram diferenças entre as digestões de amostras não oxidadas e oxidadas, levando-nos a concluir que a oxidação da proteína não influencia a sua digestão com tripsina ou proteinase K. Protein oxidative modifications are a common process in aerobic organisms. The comprehension of the processes involved in the initiation and development of these modifications can give us better insights of some common pathologies associated with the aging process. The analysis of oxidized proteins is normally based on mass spectrometric proteomic methodologies. The identification is performed with a shotgun strategy, where the protein mixture is submitted to proteolysis and the resulting peptides are analysed on a mass spectrometer. However, caution should be taken in applying these techniques in the field of protein oxidation. Oxidative modifications impose several limitations to protein identification and quantification due to the several structural and chemical modifications that occur. The enzymatic proteolysis applied before MS analysis is probably the step where one has to be especially careful, due to the occurrence of missed cleavages that difficult an efficient quantification. In this work, it was evaluated the efficiency of the proteolytic digestion with trypsin and proteinase K on oxidized bovine serum albumin (BSA). The protein was submitted to a metal-catalysed oxidation system for several incubation periods and the extent of oxidation was analysed by determining its concentration on SDS-PAGE, and the carbonyl levels by spectrophotometry and Western blot. In order to evaluate the digestion efficiency a mass spectrometry analysis based on sequence coverage of the protein after database search was carried out. We concluded that the protein suffers fragmentation during the oxidative reaction along with a substantial raise of amino acid residues side chain carbonyl levels. The digestion efficiency of the control and oxidized sample was similar, leading us to conclude that the oxidative state of the protein wasn’t an obstacle to the proteases. Mestrado em Bioquímica - Métodos Biomoleculares
As modificações oxidativas em proteínas são processos comuns em organismos aeróbios. A compreensão dos processos envolvidos na iniciação e desenvolvimento destas modificações, assim como da sua natureza, poderá contribuir para a elucidação do processo de envelhecimento, assim como de algumas patologias a ele associadas. A análise de proteínas oxidadas é comummente feita com base em técnicas proteómicas de identificação e quantificação utilizando a espectrometria de massa. A identificação é feita normalmente utilizando a análise dos péptidos resultantes de digestões proteolíticas das proteínas. No entanto, existem muitas limitações impostas pelas modificações oxidativas na utilização destas técnicas. De entre elas, a digestão enzimática a que as proteínas são sujeitas antes da análise por MS, representa talvez a que necessita de mais atenção. A ocorrência de clivagens falhadas poderá levar à impossibilidade de efetuar identificações e quantificações eficazes. Neste trabalho pretendeu-se avaliar a influência que a oxidação da albumina do soro bovina (BSA) teria na sua digestão proteolítica. Para tal procedeu-se à oxidação da BSA recorrendo-se à reação de Fenton durante vários tempos de incubação. Analisou-se posteriormente o grau de oxidação avaliando as concentrações de proteína por SDS-PAGE, os níveis de carbonilos em solução por espectrofotometria e na banda da BSA por Western Blot. A eficiência da digestão proteolítica foi avaliada por espectrometria de massa com base nas taxas de cobertura obtidas em pesquisas dos espectros em bases de dados. No final, concluiu-se que a proteína sofre uma fragmentação crescente ao longo do processo de oxidação, em consonância com um aumento crescente dos níveis de carbonilos. Pela análise da eficiência da digestão, não se verificaram diferenças entre as digestões de amostras não oxidadas e oxidadas, levando-nos a concluir que a oxidação da proteína não influencia a sua digestão com tripsina ou proteinase K. Protein oxidative modifications are a common process in aerobic organisms. The comprehension of the processes involved in the initiation and development of these modifications can give us better insights of some common pathologies associated with the aging process. The analysis of oxidized proteins is normally based on mass spectrometric proteomic methodologies. The identification is performed with a shotgun strategy, where the protein mixture is submitted to proteolysis and the resulting peptides are analysed on a mass spectrometer. However, caution should be taken in applying these techniques in the field of protein oxidation. Oxidative modifications impose several limitations to protein identification and quantification due to the several structural and chemical modifications that occur. The enzymatic proteolysis applied before MS analysis is probably the step where one has to be especially careful, due to the occurrence of missed cleavages that difficult an efficient quantification. In this work, it was evaluated the efficiency of the proteolytic digestion with trypsin and proteinase K on oxidized bovine serum albumin (BSA). The protein was submitted to a metal-catalysed oxidation system for several incubation periods and the extent of oxidation was analysed by determining its concentration on SDS-PAGE, and the carbonyl levels by spectrophotometry and Western blot. In order to evaluate the digestion efficiency a mass spectrometry analysis based on sequence coverage of the protein after database search was carried out. We concluded that the protein suffers fragmentation during the oxidative reaction along with a substantial raise of amino acid residues side chain carbonyl levels. The digestion efficiency of the control and oxidized sample was similar, leading us to conclude that the oxidative state of the protein wasn’t an obstacle to the proteases. Mestrado em Bioquímica - Métodos Biomoleculares
Document Type
Master Thesis
Language Portuguese
Advisor(s) Domingues, Pedro Miguel Dimas Neves; Silva, André Moreira Neto
Language Portuguese
Advisor(s) Domingues, Pedro Miguel Dimas Neves; Silva, André Moreira Neto
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