Author(s):
Guedes, Ana P. 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/9876
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Document details
Essential oils from plants and in vitro shoot cultures of Hypericum androsaemum...
Description
Tese de doutoramento em Ciências (ramo do conhecimento em Biologia) Apical buds and nodal segments, from plants grown in Nature were used as primary explants to establish in vitro shoot cultures of Hypericum androsaemum and Hypericum undulatum, respectively. Hypericum perforatum shoot cultures were established from nodal segments of axenic seedlings grown from seeds germinated asseptically on MS medium devoid of growth regulators. Shoot multiplication was performed by subculturing nodal segments on MS medium devoid of growth regulators, in the cases of H. perforatum and H. undulatum, and on MS medium supplemented with IAA and KIN, in the case of H. androsaemum. A modified Mg medium was used in parallel with the MS medium both devoid of growth regulators, in the case of H. undulatum. After 60 days on MS basal medium, H. undulatum cultures were characterized by a higher number of shoots and roots, comparing with the cultures grown on Mg basal medium. Essential oils (EO) from in vivo plants and in vitro cultures of H. androsaemum, H. perforatum and H. undulatum were isolated by hydrodistillation in a Clevenger type apparatus and analyzed by Gas Chromatography (GC) and Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). More than 70 compounds were identified in EO from plants of H. androsaemum L. cultivated in two places (Arouca and Arcos de Valdevez) and harvested with intervals of 2 months, over one year. Seasonal variations on the content of sesquiterpene hydrocarbons, the most represented group of compounds, were registered (42.8-72.7% in plants grown in Arouca and 43.4-78.5% in plants grown in Arcos de Valdevez). A high number of intermediate to long chain n-alkanes and 1-alkenes was recorded in EO of H. androsaemum plants grown in Arouca, in the month of February, as well as plants grown in Arcos de Valdevez, during the spring and in the end of winter. In most of the EO of this species, (Ε)-caryophyllene, β-gurjunene and γ- elemene were the major compounds independently of the experimental field. Ripened seed capsules and stems were the H. androsaemum organs with the highest and the lowest EO contents, respectively. Sesquiterpene hydrocarbons dominated the EO of leaves and stems of H. androsaemum, while monoterpene hydrocarbons dominated the EO of the ripened seed capsules. From the five most represented compounds in the EO of H. androsaemum no one was common to all the three organs (leaves, stems and ripened seed capsules). Almost 80% of the total EO of in vitro shoots of H. androsaemum was represented by sesquiterpene hydrocarbons, with γ-elemene as the only major constituent common to EO from in vitro shoots and from in Nature cultivated plants. Essential oils from aerial parts of H. perforatum plants of two cultivars (common cultivar and cv. ‘Topaz’), grown in two experimental fields and sampled over one year, revealed high levels of sesquiterpene hydrocarbons, and low levels of oxygenated compounds. Germacrene D, (E)-caryophyllene and β-selinene were the major compounds. The highest EO content was found in flowers (~12-17 mg/g of dry biomass), in which sesquiterpene hydrocarbons was the major compound group and 2-methyloctane the most represented compound (22-29%). Alkanes which represented no more than 9% of the total EO from in Nature cultivated plants, was the second major group in the EO of in vitro shoots, in which nnonane accounted for more than 24% of the total EO. Essential oils of plants and in vitro shoots of H. undulatum Schousboe ex Willd had nnonane as the major constituent, accounting for more than 40% in most of them. This compound was that most contributed for the high level of n-alkanes group in the EO of the different plant organs, notwithstanding sesquiterpene hydrocarbons constituted the dominant group. The highest yield of H. undulatum EO was obtained from leaves, followed by ripened seed capsules, flowers and stems. The EO contents observed in in vitro H. undulatum shoots (4.9-10.5 mg/g of dry weight, for MS basal medium and 4.1-9.5 mg/g of dry weight, for Mg basal medium) were higher than those observed in aerial parts of in Nature growing plants. Although variations in the composition of the EO from shoots grown on two different basal media had been registered, over the 60 days of culture, the group of alkanes was the major one independently of the culture conditions. The highest contents of n-nonane were recorded in the EO from shoots grown on Mg basal medium. In order to get hairy root cultures of H. androsaemum, H. perforatum and H. undulatum, the influence of several factors (effect of explant pre-culture, bacterial density, explant wounding, addition of acetosyringone to the bacterial suspension and co-culture medium, as well as co-culture period) were evaluated, using the A. rhizogenes-mediated transformation as the main approach. Notwithstanding the several assays performed, hairy roots production was not achieved in any of the tested explants (leaves, internodal segments and roots). No âmbito do presente trabalho, foram estabelecidas culturas in vitro de Hypericum androsaemum, Hypericum perforatum e Hypericum undulatum. As culturas in vitro de H. androsaemum e H. undulatum foram obtidas, respectivamente, a partir de gemas apicais e segmentos nodais de plantas desenvolvidas na Natureza. Os explantes primários de H. perforatum foram obtidos de plântulas desenvolvidas a partir de sementes germinadas em condições de assépsia em meio de cultura MS sem fitorreguladores. Segmentos nodais foram utilizados na multiplicação de rebentos caulinares em meio MS suplementado com IAA e KIN, no caso de H. androsaemum, meio base MS, no caso de H. perforatum e meios base MS e Mg, no caso de H. undulatum. Após 60 dias de cultura, as plântulas de H. undulatum desenvolvidas em meio MS apresentavam maior número de rebentos e raízes, do que as plântulas obtidas em meio Mg. Os óleos essenciais (OE) de plantas in vivo e culturas in vitro de H. androsaemum, H. perforatum e H. undulatum foram isolados por hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger e analisados por Cromatografia Gasosa (CG) e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (CG-EM). Mais de 70 compostos foram identificados nos OE de plantas de H. androsaemum L., cultivadas em dois locais distintos (Arouca e Arcos de Valdevez), e colhidas com a periodicidade de 2 meses. Ao longo do ano, foram registadas variações de composição traduzidas em variações dos teores percentuais dos grupos de compostos, designadamente dos hidrocarbonetos sesquiterpénicos, grupo maioritário cuja expressão variou entre 42.8% e 72.7% nos OE de plantas desenvolvidas em Arouca e entre 43.4% e 78.5% nos OE de plantas desenvolvidas em Arcos de Valdevez. Nos OE de plantas desenvolvidas em Arcos de Valdevez, durante a Primavera e no final do Inverno foi registada a acumulação de um número superior de n-alcanos, de cadeia intermédia a longa e, de 1-alcenos, ao passo que nos OE de plantas desenvolvidas em Arouca a maior diversidade de n-alcanos de cadeia intermédia a longa e 1- alcenos foi registada em Fevereiro. (Ε)-Cariofileno, β-gurjuneno e γ-elemeno foram os compostos maioritários na maioria das amostras de OE desta espécie, em ambos os campos experimentais. Os teores de OE mais elevados foram registados nos frutos e os mais baixos nos caules desta espécie. Nos OE das folhas e dos caules predominaram os hidrocarbonetos sesquiterpénicos, ao passo que nos OE dos frutos predominaram os hidrocarbonetos monoterpénicos. Dos cinco compostos maioritários dos OE de cada um dos órgãos em estudo, nenhum era comum aos três, reflectindo a dissemelhança entre eles. Cerca de 80% do total dos OE das culturas in vitro de H. androsaemum era constituído por hidrocarbonetos sesquiterpénicos, sendo o γ-elemeno o único composto deste grupo maioritário nos OE dos rebentos caulinares e das plantas cultivadas. Os OE da parte aérea de plantas das cultivares comum e ‘Topaz’ de H. perforatum, cultivadas em dois campos experimentais distintos revelaram teores elevados de hidrocarbonetos sesquiterpénicos e teores baixos de compostos oxigenados. Os compostos maioritários dos OE de ambas as cultivares foram o germacreno D, o (E)-cariofileno e o β- elemeno. Os OE de flores proporcionaram rendimentos superiores (~12-17 mg/g de biomassa seca) aos das partes aéreas das plantas. A sua composição era maioritariamente constituída por hidrocarbonetos sesquiterpénicos embora o composto maioritário fosse um alcano, o 2- metiloctano cujo teor variou de 22% a 29%. O constituinte maioritário dos rebentos caulinares foi o n-nonano (24% do OE), sendo os alcanos o segundo grupo de compostos maioritário neste tipo de culturas in vitro de H. perforatum. Nos OE de plantas e rebentos caulinares de H. undulatum Schousboe ex Willd., o nnonano foi o composto maioritário, constituindo mais de 40% do seu total na maioria das amostras analisadas. De facto, este composto foi o responsável pela elevada expressão percentual do grupo dos n-alcanos nos diferentes órgãos de H. undulatum. Nas folhas, porém, os hidrocarbonetos sesquiterpénicos foram o grupo predominante. Os teores mais elevados de OE foram registados nas folhas, seguindo-se os frutos, flores e caules. Os rendimentos em OE dos rebentos caulinares variaram de 4,9 a 10,5 mg/g de biomassa seca nas culturas mantidas em meio base MS e de 4,1 a 9,5 mg/g de biomassa seca nos rebentos caulinares desenvolvidos em meio base Mg, sendo superiores aos registados para os OE das partes aéreas das plantas. Embora se tenham verificado variações na composição dos OE de rebentos caulinares mantidos nos dois meios de cultura, o grupo dos n-alcanos foi o maioritário em ambos os casos. Os teores mais elevados de n-nonano, composto maioritário, foram registados nos rebentos caulinares desenvolvidos em meio base Mg. Na tentativa de se induzir a formação de hairy roots de H. androsaemum, H. perforatum e H. undulatum foi testada a influência de diversos factores (pré-cultura dos explantes, densidade bacteriana, ferimento dos explantes, adição de acetoseringona à suspensão bacteriana e ao meio de co-cultura, e período de co-cultura) na transformação das referidas espécies mediada por A. rhizogenes A4. Apesar dos diversos ensaios realizados, não se verificou a produção de hairy roots em nenhum dos explantes utilizados (folhas, segmentos internodais e raízes).
Tese de doutoramento em Ciências (ramo do conhecimento em Biologia) Apical buds and nodal segments, from plants grown in Nature were used as primary explants to establish in vitro shoot cultures of Hypericum androsaemum and Hypericum undulatum, respectively. Hypericum perforatum shoot cultures were established from nodal segments of axenic seedlings grown from seeds germinated asseptically on MS medium devoid of growth regulators. Shoot multiplication was performed by subculturing nodal segments on MS medium devoid of growth regulators, in the cases of H. perforatum and H. undulatum, and on MS medium supplemented with IAA and KIN, in the case of H. androsaemum. A modified Mg medium was used in parallel with the MS medium both devoid of growth regulators, in the case of H. undulatum. After 60 days on MS basal medium, H. undulatum cultures were characterized by a higher number of shoots and roots, comparing with the cultures grown on Mg basal medium. Essential oils (EO) from in vivo plants and in vitro cultures of H. androsaemum, H. perforatum and H. undulatum were isolated by hydrodistillation in a Clevenger type apparatus and analyzed by Gas Chromatography (GC) and Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). More than 70 compounds were identified in EO from plants of H. androsaemum L. cultivated in two places (Arouca and Arcos de Valdevez) and harvested with intervals of 2 months, over one year. Seasonal variations on the content of sesquiterpene hydrocarbons, the most represented group of compounds, were registered (42.8-72.7% in plants grown in Arouca and 43.4-78.5% in plants grown in Arcos de Valdevez). A high number of intermediate to long chain n-alkanes and 1-alkenes was recorded in EO of H. androsaemum plants grown in Arouca, in the month of February, as well as plants grown in Arcos de Valdevez, during the spring and in the end of winter. In most of the EO of this species, (Ε)-caryophyllene, β-gurjunene and γ- elemene were the major compounds independently of the experimental field. Ripened seed capsules and stems were the H. androsaemum organs with the highest and the lowest EO contents, respectively. Sesquiterpene hydrocarbons dominated the EO of leaves and stems of H. androsaemum, while monoterpene hydrocarbons dominated the EO of the ripened seed capsules. From the five most represented compounds in the EO of H. androsaemum no one was common to all the three organs (leaves, stems and ripened seed capsules). Almost 80% of the total EO of in vitro shoots of H. androsaemum was represented by sesquiterpene hydrocarbons, with γ-elemene as the only major constituent common to EO from in vitro shoots and from in Nature cultivated plants. Essential oils from aerial parts of H. perforatum plants of two cultivars (common cultivar and cv. ‘Topaz’), grown in two experimental fields and sampled over one year, revealed high levels of sesquiterpene hydrocarbons, and low levels of oxygenated compounds. Germacrene D, (E)-caryophyllene and β-selinene were the major compounds. The highest EO content was found in flowers (~12-17 mg/g of dry biomass), in which sesquiterpene hydrocarbons was the major compound group and 2-methyloctane the most represented compound (22-29%). Alkanes which represented no more than 9% of the total EO from in Nature cultivated plants, was the second major group in the EO of in vitro shoots, in which nnonane accounted for more than 24% of the total EO. Essential oils of plants and in vitro shoots of H. undulatum Schousboe ex Willd had nnonane as the major constituent, accounting for more than 40% in most of them. This compound was that most contributed for the high level of n-alkanes group in the EO of the different plant organs, notwithstanding sesquiterpene hydrocarbons constituted the dominant group. The highest yield of H. undulatum EO was obtained from leaves, followed by ripened seed capsules, flowers and stems. The EO contents observed in in vitro H. undulatum shoots (4.9-10.5 mg/g of dry weight, for MS basal medium and 4.1-9.5 mg/g of dry weight, for Mg basal medium) were higher than those observed in aerial parts of in Nature growing plants. Although variations in the composition of the EO from shoots grown on two different basal media had been registered, over the 60 days of culture, the group of alkanes was the major one independently of the culture conditions. The highest contents of n-nonane were recorded in the EO from shoots grown on Mg basal medium. In order to get hairy root cultures of H. androsaemum, H. perforatum and H. undulatum, the influence of several factors (effect of explant pre-culture, bacterial density, explant wounding, addition of acetosyringone to the bacterial suspension and co-culture medium, as well as co-culture period) were evaluated, using the A. rhizogenes-mediated transformation as the main approach. Notwithstanding the several assays performed, hairy roots production was not achieved in any of the tested explants (leaves, internodal segments and roots). No âmbito do presente trabalho, foram estabelecidas culturas in vitro de Hypericum androsaemum, Hypericum perforatum e Hypericum undulatum. As culturas in vitro de H. androsaemum e H. undulatum foram obtidas, respectivamente, a partir de gemas apicais e segmentos nodais de plantas desenvolvidas na Natureza. Os explantes primários de H. perforatum foram obtidos de plântulas desenvolvidas a partir de sementes germinadas em condições de assépsia em meio de cultura MS sem fitorreguladores. Segmentos nodais foram utilizados na multiplicação de rebentos caulinares em meio MS suplementado com IAA e KIN, no caso de H. androsaemum, meio base MS, no caso de H. perforatum e meios base MS e Mg, no caso de H. undulatum. Após 60 dias de cultura, as plântulas de H. undulatum desenvolvidas em meio MS apresentavam maior número de rebentos e raízes, do que as plântulas obtidas em meio Mg. Os óleos essenciais (OE) de plantas in vivo e culturas in vitro de H. androsaemum, H. perforatum e H. undulatum foram isolados por hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger e analisados por Cromatografia Gasosa (CG) e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (CG-EM). Mais de 70 compostos foram identificados nos OE de plantas de H. androsaemum L., cultivadas em dois locais distintos (Arouca e Arcos de Valdevez), e colhidas com a periodicidade de 2 meses. Ao longo do ano, foram registadas variações de composição traduzidas em variações dos teores percentuais dos grupos de compostos, designadamente dos hidrocarbonetos sesquiterpénicos, grupo maioritário cuja expressão variou entre 42.8% e 72.7% nos OE de plantas desenvolvidas em Arouca e entre 43.4% e 78.5% nos OE de plantas desenvolvidas em Arcos de Valdevez. Nos OE de plantas desenvolvidas em Arcos de Valdevez, durante a Primavera e no final do Inverno foi registada a acumulação de um número superior de n-alcanos, de cadeia intermédia a longa e, de 1-alcenos, ao passo que nos OE de plantas desenvolvidas em Arouca a maior diversidade de n-alcanos de cadeia intermédia a longa e 1- alcenos foi registada em Fevereiro. (Ε)-Cariofileno, β-gurjuneno e γ-elemeno foram os compostos maioritários na maioria das amostras de OE desta espécie, em ambos os campos experimentais. Os teores de OE mais elevados foram registados nos frutos e os mais baixos nos caules desta espécie. Nos OE das folhas e dos caules predominaram os hidrocarbonetos sesquiterpénicos, ao passo que nos OE dos frutos predominaram os hidrocarbonetos monoterpénicos. Dos cinco compostos maioritários dos OE de cada um dos órgãos em estudo, nenhum era comum aos três, reflectindo a dissemelhança entre eles. Cerca de 80% do total dos OE das culturas in vitro de H. androsaemum era constituído por hidrocarbonetos sesquiterpénicos, sendo o γ-elemeno o único composto deste grupo maioritário nos OE dos rebentos caulinares e das plantas cultivadas. Os OE da parte aérea de plantas das cultivares comum e ‘Topaz’ de H. perforatum, cultivadas em dois campos experimentais distintos revelaram teores elevados de hidrocarbonetos sesquiterpénicos e teores baixos de compostos oxigenados. Os compostos maioritários dos OE de ambas as cultivares foram o germacreno D, o (E)-cariofileno e o β- elemeno. Os OE de flores proporcionaram rendimentos superiores (~12-17 mg/g de biomassa seca) aos das partes aéreas das plantas. A sua composição era maioritariamente constituída por hidrocarbonetos sesquiterpénicos embora o composto maioritário fosse um alcano, o 2- metiloctano cujo teor variou de 22% a 29%. O constituinte maioritário dos rebentos caulinares foi o n-nonano (24% do OE), sendo os alcanos o segundo grupo de compostos maioritário neste tipo de culturas in vitro de H. perforatum. Nos OE de plantas e rebentos caulinares de H. undulatum Schousboe ex Willd., o nnonano foi o composto maioritário, constituindo mais de 40% do seu total na maioria das amostras analisadas. De facto, este composto foi o responsável pela elevada expressão percentual do grupo dos n-alcanos nos diferentes órgãos de H. undulatum. Nas folhas, porém, os hidrocarbonetos sesquiterpénicos foram o grupo predominante. Os teores mais elevados de OE foram registados nas folhas, seguindo-se os frutos, flores e caules. Os rendimentos em OE dos rebentos caulinares variaram de 4,9 a 10,5 mg/g de biomassa seca nas culturas mantidas em meio base MS e de 4,1 a 9,5 mg/g de biomassa seca nos rebentos caulinares desenvolvidos em meio base Mg, sendo superiores aos registados para os OE das partes aéreas das plantas. Embora se tenham verificado variações na composição dos OE de rebentos caulinares mantidos nos dois meios de cultura, o grupo dos n-alcanos foi o maioritário em ambos os casos. Os teores mais elevados de n-nonano, composto maioritário, foram registados nos rebentos caulinares desenvolvidos em meio base Mg. Na tentativa de se induzir a formação de hairy roots de H. androsaemum, H. perforatum e H. undulatum foi testada a influência de diversos factores (pré-cultura dos explantes, densidade bacteriana, ferimento dos explantes, adição de acetoseringona à suspensão bacteriana e ao meio de co-cultura, e período de co-cultura) na transformação das referidas espécies mediada por A. rhizogenes A4. Apesar dos diversos ensaios realizados, não se verificou a produção de hairy roots em nenhum dos explantes utilizados (folhas, segmentos internodais e raízes).
Document Type
Doctoral Thesis
Language English
Advisor(s) Ferreira, Manuel Fernandes
Language English
Advisor(s) Ferreira, Manuel Fernandes
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