Author(s):
Correia, Joana Silva 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/9521
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Subject(s): Arabidopsis thaliana; Functional genomics; Heat stress responsive genes; Populus euphratica; Reverse genetics; Thermotolerance; Genes de resposta ao stress térmico; Genética inversa; Genómica funcional; Populus euphratica; Termotolerância
Description
Tese de doutoramento em Ciências One of the most typical abiotic stresses encountered by plants is extreme
temperatures. High temperature leads to a series of morphological, physiological and
molecular alterations that adversely affect plant growth and productivity. Acquisition of
thermotolerance is largely controlled through molecular mechanisms based on the activation
and regulation of specific stress‐related genes. The elucidation of these gene/protein functions
will give insights on the various mechanisms of plant response to heat stress, providing useful
information to improve plant thermotolerance. The present work aims to contribute for the
understanding of the molecular mechanisms that are responsible for plant adaptation to heat
stress. Two species, Populus euphratica Oliv. and Arabidopsis thaliana L., were used as models
due to the latest development of genomic and molecular biology resources and tools for both
plants.
P. euphratica is naturally found under severe conditions such as extreme temperatures
(‐45°C to +54°C), high soil salinity and drought. The physiological response of P. euphratica
cultured cells was evaluated at different temperatures. Contrasting with its innate enhanced
tolerance to extreme temperatures, the in vitro system did not present an outstanding
tolerance capacity. P. euphratica suspended cells heat‐shocked for 20 min were able to
tolerate temperatures up to 45°C. Heat‐associated events as PCD and ROS production were
suggested not to be implicated in the occurring cell death.
Supported by the use of publicly available A. thaliana expression data and other webbased
tools and resources, a reverse genetics strategy was followed for the identification of
novel determinants for heat stress tolerance (HZF and HRR). In silico analysis revealed that
both genes putatively encode effector proteins involved in different stages of the heat stress
response. Moreover, HZF and HRR were found to be co‐regulated with genes already
implicated in the regulation of heat responses. Functional characterization of HZF was
primarily supported by the use of several web‐based tools and resources specifically created
for Arabidopsis functional analysis. HZF was found to be a zinc finger family protein containing
a conserved C3H2C3‐type RING domain and its possible role as E3 ubiquitin ligase was
suggested. To pursue with reverse genetics approaches for identifying heat stress‐associated
mutations, a phenotypic analysis based on germination and seedling survival assays was
proposed. Temperatures and periods of treatment were diversely combined to test basal
thermotolerance in either seeds or 7‐day‐old seedlings, or acquired thermotolerance only in 7‐
day‐old seedlings. The effectiveness of the proposed protocols was illustrated by detection of
heat‐associated phenotypes in two mutants (hot1‐3 and atrbohD) previously identified to be
thermotolerance defective. Regarding germination assays, special attention should be given to
the time‐course evaluation of the number of germinated seeds for an accurate phenotypic
detection. A delayed germination was observed in hzf mutant seeds in the following days after
heat treatment when compared to wild‐type seeds, suggesting a role for HZF in the transition
from dormant to germinating state. HZF was then suggested to mediate the ubiquitination of a
regulator protein implicated in promoting seed dormancy or repressing germination upon heat
stress. This function seems to be mainly assured by a redundant gene product (L‐HZF) under
standard conditions, since similar germination timing was observed for hzf and wild‐type
seeds. Maximum HZF transcript accumulation in heat‐treated (38°C for 1 h) wild‐type seedlings
was achieved 15 min after heat treatment, suggesting also the HZF involvement in the initial
phase of heat stress response. Expression vectors suitable for overexpression studies and in
situ analysis were constructed and used to transform wild‐type Arabidopsis plants. The
transgenic T3 plants will be soon available for further experiments that will contribute to
elucidate the specific role of HZF in thermotolerance. The complete functional characterization
of HZF, currently in progress, will provide novel information that would contribute to the
dissection of its particular role in plant thermotolerance. A temperatura extrema constitui um dos principais factores de stresse abiótico a que as plantas estão frequentemente sujeitas. A exposição a temperaturas elevadas resulta em
alterações profundas do metabolismo, executadas a nível morfológico, fisiológico e molecular,
que prejudicam o desenvolvimento e produtividade vegetal. A aquisição de termotolerância é
essencialmente controlada por mecanismos moleculares, os quais incluem a activação e
regulação de genes específicos associados ao stresse. A elucidação da função desses
genes/proteínas irá contribuir para a compreensão dos mecanismos de resposta das plantas
que permitem a aquisição de tolerância a temperaturas elevadas. O conhecimento desses
mecanismos poderá ainda ser utilizado na implementação de estratégias para o aumento da
termotolerância em plantas. O presente trabalho pretende contribuir para o conhecimento
dos mecanismos moleculares responsáveis pela adaptação ao stresse térmico em plantas.
Duas espécies, Populus euphratica Oliv. e Arabidopsis thaliana L., foram utilizadas como
modelos, devido ao recente desenvolvimento de recursos e ferramentas genómicas e de
biologia molecular.
P. euphratica encontra‐se distribuída em ambientes adversos, designadamente
apresentando temperaturas extremas (‐45°C a +54°C), elevada salinidade e secura. Neste
trabalho, procedeu‐se à caracterização fisiológica de células em suspensão de P. euphratica a
diferentes temperaturas. Contrariamente à elevada termotolerância inata, o sistema in vitro
não apresentou termotolerância significativa. As células em suspensão de P. euphratica,
sujeitas a stresse térmico durante 20 min, atingiram um máximo de tolerância para
temperaturas inferiores a 45°C. A avaliação de processos associados à resposta a temperaturas
elevadas, como a morte celular programada ou a produção de espécies reactivas de oxigénio,
sugeriu que estes não se encontram implicados na morte celular observada.
Fazendo uso de informação sobre expressão genética e outras ferramentas e recursos
disponibilizados publicamente para a espécie A. thaliana, foi efectuada a identificação de
novos determinantes para a tolerância ao stresse térmico (HZF e HRR). A análise in silico
revelou que ambos os genes possivelmente codificam proteínas efectoras envolvidas em
diferentes estádios da resposta ao stresse térmico. A análise de genes que apresentam co-expressão com HZF e HRR permitiu identificar outros genes implicados na regulação de
respostas a temperaturas elevadas. A caracterização funcional do gene HZF foi inicialmente
suportada pelo uso de ferramentas e recursos disponíveis on‐line especialmente concebidos
para análise funcional em Arabidopsis. HZF foi identificado como sendo uma proteína da
família zinc finger, que possui um domínio conservado do tipo RING C3H2C3, tendo sido
sugerida a sua possível função como E3 ubiquitina ligase.
De forma a prosseguir a metodologia de genética inversa, para a identificação de
mutações associadas ao stresse térmico, foi proposta uma análise fenotípica baseada em
ensaios de germinação e viabilidade de plântulas de A. thaliana. Os protocolos utilizados
abrangeram uma combinação de temperaturas e tempos de tratamento térmico, para avaliar
a termotolerância basal em sementes e plântulas com 7 dias, ou a termotolerância adquirida
em plântulas com 7 dias. A eficácia dos protocolos foi demonstrada através da identificação de
fenótipos associados ao calor em dois mutantes (hot1‐3 e atrbohD), cuja termotolerância
reduzida tinha sido previamente descrita. No que se refere aos ensaios de germinação, foi
sugerida a avaliação do número de sementes germinadas ao longo do tempo para uma
detecção fenotípica mais precisa. Quando comparadas com as sementes da estirpe selvagem,
as sementes do mutante hzf exibiram atraso na germinação nos dias seguintes ao tratamento
térmico, sugerindo o envolvimento de HZF na transição na fase de dormência para o estado
germinativo. A proteína HZF foi então sugerida como mediadora da ubiquitinação de uma
proteína reguladora implicada na manutenção da dormência ou repressão da germinação em
condições de stresse térmico. Esta função parece ser principalmente assegurada por uma
outra proteína com função redundante (L‐HZF) em condições normais, dado que o tempo de
germinação observado para as sementes hzf e selvagem foi semelhante. A máxima
acumulação de transcriptos de HZF em plântulas selvagem sujeitas a stress térmico (38°C
durante 1 h) foi observada 15 min após tratamento, o que sugeriu também o envolvimento de
HZF na fase inicial da resposta ao stresse térmico. Vectores de expressão apropriados para
estudos de sobre‐expressão e análise in situ foram concebidos e utilizados na transformação
de plântulas selvagem de A. thaliana. As plantas transgénicas T3 estarão brevemente
disponíveis para ensaios suplementares que irão contribuir para esclarecer a função específica
de HZF na termotolerância. A caracterização funcional completa do gene HZF, actualmente em
curso, irá fornecer informação adicional que poderá contribuir para a elucidação do seu papel
particular na termotolerância de plantas.
