Autor(es):
Alves, Cláudio António Nunes 
Data: 2013
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/1822/25462
Origem: RepositóriUM - Universidade do Minho
Detalhes do Documento
T cell immunity to mycobacteria : the problem of thymic infection and new + mou...
Descrição
Tese de doutoramento em Ciências da Saúde Despite significant advances in drug discovery and vaccination strategies during the last decades, infectious diseases are still a major health problem worldwide. Among these, infections by mycobacteria are particularly deadly, and Mycobacterium tuberculosis alone – the causative agent of tuberculosis – is estimated to infect a third of the world population and is responsible for 9 million new cases and 1.5 million deaths every year. Interestingly, most people do not develop active disease following infection, but instead are capable of controlling infection and remain in an asymptomatic state termed latent infection. Although how the immune system controls infection is unclear, it is clear that T cells are a key component of a successful response against mycobacteria, since infection with human immunodeficiency virus (HIV) greatly increases susceptibility to infection. Because T cells play such an important role in controlling mycobacterial infections, there is considerable interest in understanding which subsets are necessary for protection, which mechanisms are employed by these cells to limit bacterial growth, and whether such cells can be elicited by vaccination strategies. To clarify the role of T cells during immunity to tuberculosis, we addressed two aspects of T cell biology: how infection impacts the thymus, the organ where T cells differentiate; and how CD8+ T cells mediate protection during tuberculosis. Our lab had previously shown that mycobacteria could disseminate to the thymus and interfere with thymic function. However, it was unclear whether the immune system could control thymic infection and halt bacterial growth in this organ. Here we show that an immune response is recruited to the infected thymus and controls infection. This response involves the production of pro-inflammatory cytokines by antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells, which stimulate infected cells and leads to control of bacterial replication. Interestingly, these T cells are not cells undergoing differentiation in the thymus, but rather are activated cells that recirculate from infected peripheral organs to the thymus to fight infection. This recruitment is associated with the production of the chemokines CXCL9 and CXCL10 in the infected thymus, and recirculating antigen-specific T cells that express CXCR3 and preferentially traffic to the thymus. In a second set of studies, we investigate how CD8+ T cells contribute to immunity against M. tuberculosis infection. Although CD8+ T cells are essential for optimal immunity during tuberculosis, how they exert protection is unclear. Here we describe the generation of a new mouse model, the first carrying T cells expressing a recombinant T cell receptor (TCR) specific for a M. tuberculosis antigen recognized by CD8+ T cells – TB10. By combining single cell sorting of antigen-specific cells with PCR amplification of their TCRs, we selected 4 TCR candidates specific for TB10. These TCRs were cloned into retroviral vectors and used in retrovirus-mediated stem cell gene transfer to generate retrogenic mice. These mice express CD8+ T cells that recognize and respond to their cognate peptide. More importantly, adoptive transfer of retrogenic cells provides protection against aerosol infection with M. tuberculosis. We then use these mice to investigate the mechanism by which CD8+ T cells mediate protection. By using retrogenic mice that are deficient in the production of interferon-γ or perforin, we show that protection mediated by CD8+ T cells requires cytokine production but is independent of their cytotoxic capacity. Collectively, the studies presented in this thesis clarify different aspects of T cell-mediated immunity to mycobacteria; they reinforce that the thymus is not an immune privileged organ and should be studied in the context of infection, and strengthen the notion that CD8+ T cells are protective after M. tuberculosis infection Nas últimas décadas observamos incríveis avanços tanto no desenvolvimento de vacinas como de antibióticos. No entanto, as doenças infecciosas continuam a ser um problema de saúde global. Entre estas, as infecções por micobactérias são particularmente mortiferas, e é estimado que um terço da população mundial esteja infectada com Mycobacterium tuberculosis – a bacteria responsável pela tuberculose. Esta doença causa 9 milhões de novos casos todos os anos, resultando em cerca de 1.5 milhões de mortes anuais. No entanto, a maioria dos indivíduos infectados não desenvolve a doença, e permanence num estadio clinico assimptomatico designado por infecção latente. Apesar de ainda não ser claro como é que o sistema imunitário controla estas infecções, as células T são um componente essencial neste processo, já que infecção com o virus de imunodeficiencia humana (VIH) aumenta significativamente a susceptibilidade à infecção com micobactérias. Devido à importância das células T nestes casos, é importante clarificar que subconjuntos destas células são necessários para controlar a infecção, como é que essas células são protectoras, e se é possível gerá-las por intermédio de vacinas. Para melhor entender qual o papel das células T durante infecções por micobactérias, focamo-nos em dois pontos: qual o impacto destas infecções no timo, o orgão em que as células T se diferienciam; e qual o papel das células T CD8+ durante a tuberculose. Quando iniciamos estes estudos, era sabido que micobactérias são capazes de disseminar para o timo e interferir com a função deste orgão. No entanto não era claro se o timo consegue controlar estas infecções, e como o faz. Nos estudos aqui apresentados demonstramos que o timo controla a infecção, num processo dependente do recrutamento de uma resposta imunitária adquirida para este orgão. Esta resposta envolve a produção de citocinas pró-inflamatórias por parte de células T, tanto CD4+ como CD8+. Estas citocinas activam as células infectadas, resultando no controlo do crescimento bacteriano no timo. Apesar do timo ser o orgão em que as células T se diferenciam, os nossos estudos revelam que as células responsáveis pelo controlo bacteriano neste orgão não são células que se encontram neste orgão no processo de diferenciação, mas antes células T activadas que recirculam dos orgãos periféricos para o timo para controlar a infecção. Este processo depende da produção das quimoquinas CXCL9 e CXCL10 no timo infectado, e da expressão do receptor CXCR3 por parte das células que recirculam. Num conjunto de estudos diferentes debruçamo-nos sobre a contribuição das células T CD8+ durante a tuberculose. Apesar de ser aceite que estas células são importantes durante a infecção com M. tuberculosis, o mecanismo pelo qual elas protegem indivíduos infectados é ainda desconhecido. Para investigar esta questão criamos um novo modelo animal, o primeiro ratinho que expressa células T CD8+ específicas para um antigénio de M. tuberculosis, o antigénio TB10. Para tal, células específicas para TB10 foram isoladas individualmente por citometria de fluxo, os seus receptores de células T (TCR) amplificados por reacção em cadeia de polimerase (PCR) e sequenciados. Das sequências detectadas, 4 foram seleccionadas e clonadas em vectores retrovirais, que foram depois usados para gerar animais retrogénicos, via transferência adoptiva de células estaminais infectadas com os retrovirus. Estes animais expressam células T CD8+ que reconhecem o antigénio de interesse, e transferência adoptiva de células retrogénicas é suficiente para proteger significativamente animais de infecção aerogénica com M. tuberculosis. Para investigar qual o mecanismo responsável pela protecção observada, geramos animais retrogénicos incapazes de produzir interferão-γ ou perforina, e demonstramos que as células T CD8+ precisam de produzir citocinas, mas não de ser citotóxicas, para proteger animais contra infecção por tuberculose. Em conjunto os estudos apresentados nesta tese clarificam diferentes aspectos acerca da imunidade mediada por células T durante infecções com micobactérias: re-enforçam a ideia de que o timo não é um orgão imuno-priveligiado e deve ser estudado no contexto de doenças infecciosas; e que as células T CD8+ são protectoras no contexto de tuberculose.
Tese de doutoramento em Ciências da Saúde Despite significant advances in drug discovery and vaccination strategies during the last decades, infectious diseases are still a major health problem worldwide. Among these, infections by mycobacteria are particularly deadly, and Mycobacterium tuberculosis alone – the causative agent of tuberculosis – is estimated to infect a third of the world population and is responsible for 9 million new cases and 1.5 million deaths every year. Interestingly, most people do not develop active disease following infection, but instead are capable of controlling infection and remain in an asymptomatic state termed latent infection. Although how the immune system controls infection is unclear, it is clear that T cells are a key component of a successful response against mycobacteria, since infection with human immunodeficiency virus (HIV) greatly increases susceptibility to infection. Because T cells play such an important role in controlling mycobacterial infections, there is considerable interest in understanding which subsets are necessary for protection, which mechanisms are employed by these cells to limit bacterial growth, and whether such cells can be elicited by vaccination strategies. To clarify the role of T cells during immunity to tuberculosis, we addressed two aspects of T cell biology: how infection impacts the thymus, the organ where T cells differentiate; and how CD8+ T cells mediate protection during tuberculosis. Our lab had previously shown that mycobacteria could disseminate to the thymus and interfere with thymic function. However, it was unclear whether the immune system could control thymic infection and halt bacterial growth in this organ. Here we show that an immune response is recruited to the infected thymus and controls infection. This response involves the production of pro-inflammatory cytokines by antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells, which stimulate infected cells and leads to control of bacterial replication. Interestingly, these T cells are not cells undergoing differentiation in the thymus, but rather are activated cells that recirculate from infected peripheral organs to the thymus to fight infection. This recruitment is associated with the production of the chemokines CXCL9 and CXCL10 in the infected thymus, and recirculating antigen-specific T cells that express CXCR3 and preferentially traffic to the thymus. In a second set of studies, we investigate how CD8+ T cells contribute to immunity against M. tuberculosis infection. Although CD8+ T cells are essential for optimal immunity during tuberculosis, how they exert protection is unclear. Here we describe the generation of a new mouse model, the first carrying T cells expressing a recombinant T cell receptor (TCR) specific for a M. tuberculosis antigen recognized by CD8+ T cells – TB10. By combining single cell sorting of antigen-specific cells with PCR amplification of their TCRs, we selected 4 TCR candidates specific for TB10. These TCRs were cloned into retroviral vectors and used in retrovirus-mediated stem cell gene transfer to generate retrogenic mice. These mice express CD8+ T cells that recognize and respond to their cognate peptide. More importantly, adoptive transfer of retrogenic cells provides protection against aerosol infection with M. tuberculosis. We then use these mice to investigate the mechanism by which CD8+ T cells mediate protection. By using retrogenic mice that are deficient in the production of interferon-γ or perforin, we show that protection mediated by CD8+ T cells requires cytokine production but is independent of their cytotoxic capacity. Collectively, the studies presented in this thesis clarify different aspects of T cell-mediated immunity to mycobacteria; they reinforce that the thymus is not an immune privileged organ and should be studied in the context of infection, and strengthen the notion that CD8+ T cells are protective after M. tuberculosis infection Nas últimas décadas observamos incríveis avanços tanto no desenvolvimento de vacinas como de antibióticos. No entanto, as doenças infecciosas continuam a ser um problema de saúde global. Entre estas, as infecções por micobactérias são particularmente mortiferas, e é estimado que um terço da população mundial esteja infectada com Mycobacterium tuberculosis – a bacteria responsável pela tuberculose. Esta doença causa 9 milhões de novos casos todos os anos, resultando em cerca de 1.5 milhões de mortes anuais. No entanto, a maioria dos indivíduos infectados não desenvolve a doença, e permanence num estadio clinico assimptomatico designado por infecção latente. Apesar de ainda não ser claro como é que o sistema imunitário controla estas infecções, as células T são um componente essencial neste processo, já que infecção com o virus de imunodeficiencia humana (VIH) aumenta significativamente a susceptibilidade à infecção com micobactérias. Devido à importância das células T nestes casos, é importante clarificar que subconjuntos destas células são necessários para controlar a infecção, como é que essas células são protectoras, e se é possível gerá-las por intermédio de vacinas. Para melhor entender qual o papel das células T durante infecções por micobactérias, focamo-nos em dois pontos: qual o impacto destas infecções no timo, o orgão em que as células T se diferienciam; e qual o papel das células T CD8+ durante a tuberculose. Quando iniciamos estes estudos, era sabido que micobactérias são capazes de disseminar para o timo e interferir com a função deste orgão. No entanto não era claro se o timo consegue controlar estas infecções, e como o faz. Nos estudos aqui apresentados demonstramos que o timo controla a infecção, num processo dependente do recrutamento de uma resposta imunitária adquirida para este orgão. Esta resposta envolve a produção de citocinas pró-inflamatórias por parte de células T, tanto CD4+ como CD8+. Estas citocinas activam as células infectadas, resultando no controlo do crescimento bacteriano no timo. Apesar do timo ser o orgão em que as células T se diferenciam, os nossos estudos revelam que as células responsáveis pelo controlo bacteriano neste orgão não são células que se encontram neste orgão no processo de diferenciação, mas antes células T activadas que recirculam dos orgãos periféricos para o timo para controlar a infecção. Este processo depende da produção das quimoquinas CXCL9 e CXCL10 no timo infectado, e da expressão do receptor CXCR3 por parte das células que recirculam. Num conjunto de estudos diferentes debruçamo-nos sobre a contribuição das células T CD8+ durante a tuberculose. Apesar de ser aceite que estas células são importantes durante a infecção com M. tuberculosis, o mecanismo pelo qual elas protegem indivíduos infectados é ainda desconhecido. Para investigar esta questão criamos um novo modelo animal, o primeiro ratinho que expressa células T CD8+ específicas para um antigénio de M. tuberculosis, o antigénio TB10. Para tal, células específicas para TB10 foram isoladas individualmente por citometria de fluxo, os seus receptores de células T (TCR) amplificados por reacção em cadeia de polimerase (PCR) e sequenciados. Das sequências detectadas, 4 foram seleccionadas e clonadas em vectores retrovirais, que foram depois usados para gerar animais retrogénicos, via transferência adoptiva de células estaminais infectadas com os retrovirus. Estes animais expressam células T CD8+ que reconhecem o antigénio de interesse, e transferência adoptiva de células retrogénicas é suficiente para proteger significativamente animais de infecção aerogénica com M. tuberculosis. Para investigar qual o mecanismo responsável pela protecção observada, geramos animais retrogénicos incapazes de produzir interferão-γ ou perforina, e demonstramos que as células T CD8+ precisam de produzir citocinas, mas não de ser citotóxicas, para proteger animais contra infecção por tuberculose. Em conjunto os estudos apresentados nesta tese clarificam diferentes aspectos acerca da imunidade mediada por células T durante infecções com micobactérias: re-enforçam a ideia de que o timo não é um orgão imuno-priveligiado e deve ser estudado no contexto de doenças infecciosas; e que as células T CD8+ são protectoras no contexto de tuberculose.
Tipo de Documento
Tese de Doutoramento
Idioma Inglês
Orientador(es) Neves, Margarida Correia; Behar, Samuel; Benoist, Christophe
Idioma Inglês
Orientador(es) Neves, Margarida Correia; Behar, Samuel; Benoist, Christophe
| Financiadores do RCAAP | |||||||
|
|
|
|
|
|
||