Autor(es):
Pirraco, Rogério 
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/1822/19686
Origem: RepositóriUM - Universidade do Minho
Detalhes do Documento
Co-cultures and cell sheet engineering as relevant tools to improve the outcome...
Descrição
Taking into consideration the complex biology of bone tissue it is quite clear that the understanding of the cellular interactions that regulate the homeostasis and regeneration of this remarkable tissue is essential for a successful Tissue Engineering strategy. The in vitro study of these cellular interactions relies on co-culture systems, a tremendously useful methodology where two or more cell types are cultured at the same time. Such strategy increases the complexity of typical monoculture systems, allowing the in vitro settings to closely mimic the in vivo environment. Moreover, 2D coculture systems have been extensively used by cell biologists to study cell interactions as an attempt to understand specific cellular mechanisms and signalling pathways. The interaction between osteoblasts/ osteoprogenitor cells and different cell types relevant within the bone Tissue Engineering context, namely mononuclear cells from peripheral blood and umbilical cord blood and fibroblasts, has been addressed in the first part of this thesis. The different co-cultures showed that mononuclear cells from peripheral blood were capable of accelerating the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by producing BMP-2. On the other hand, osteoblasts cultured on carrageenan membranes were capable of supporting the culture of endothelial progenitors cells present in the mononuclear fraction of umbilical cord blood that contributed to the in vivo angiogenesis after implantation in an inflammatory setting. Furthermore, fibroblasts, which are key players in the formation of fibrotic tissue after a biomaterial implantation, were shown to decrease the osteogenic activity of osteoblasts through gap junctional communication. A serious limitation of the paradigmatic use of scaffolds for bone Tissue Engineering is the lack of oxygen and nutrient supply to the cells in the core of the engineered construct leading to cell necrosis at the bulk of the constructs. Furthermore, foreign body response to the implanted biomaterial is a frequent reaction of the host and has as a consequence the formation of fibrotic tissue surrounding the implant. The use of cell sheet engineering for bone Tissue Engineering can potentially avoid those shortcomings. One of the explored strategies comprised the production of osteogenic cell sheets using this technology. Its potential for in vivo bone formation was analyzed and the formation of vascularized bone tissue with a marrow was originally demonstrated by implanting a single osteogenic cell sheet in a nude mice model. Furthermore, in order to promote vascularization, co-cultured osteogenic cell sheets with endothelial cells were also created. Endothelial cells, stacked in between osteogenic cell sheets, were proven to contribute to new vessel formation and increased bone formation in vivo This thesis demonstrates that monocytes/macrophages from peripheral blood can accelerate the osteogenic differentiation of osteoprogenitor cells while fibroblasts, have a deleterious effect on the osteogenic phenotype of osteoblasts. In addition, within an inflammatory host reaction, cells from the mononuclear fraction of umbilical cord blood were capable of contributing to new blood vessel formation after co-culture with osteoblasts. Moreover, when using the cell sheet technology to fabricate a bone tissue engineering construct, endothelial cells were also shown to improve in vivo bone formation. Considerando a complexa biologia do tecido ósseo torna-se claro que compreender as interacções celulares que regulam a homeostasia e regeneração deste tecido notável, é de extrema importância numa estratégia de Engenharia de Tecidos. O estudo in vitro destas interacções celulares baseia-se em sistemas de co-cultura, uma metodologia de grande utilidade onde dois ou mais tipos de células diferentes são cultivados simultaneamente e no mesmo espaço. Estes sistemas representam um aumento de complexidade, em relação aos sistemas de monocultura, que permite que as condições in vitro mimetizem melhor o ambiente in vivo. Além disso, sistemas de cultura 2D têm sido muito utilizados por biólogos no estudo de interacções celulares numa tentativa de compreender os mecanismos e vias de sinalização envolvidas. A interacção entre osteoblastos ou células osteoprogenitoras com células mononucleares do sangue periférico e do cordão umbilical, e com fibroblastos para aplicações em Engenharia de Tecido Ósseo foi estudada na primeira parte desta tese. As diferentes co-culturas permitiram mostrar que as células mononucleares do sangue periférico são capazes de acelerar a diferenciação osteogénica de células do estroma de medula óssea humana através da produção de proteína morfogenética do osso 2 (BMP-2). Por outro lado, foi também demonstrado que osteoblastos cultivados em membranas de carragenano suportam a cultura de células progenitoras endoteliais presentes na fracção mononuclear de sangue do cordão umbilical humano e que estas, por sua vez, contribuem para a angiogénese in vivo e em condições inflamatórias. Além disso, foi mostrado que fibroblastos, células-chave na deposição de tecido fibrótico após a implantação de um biomaterial, inibem a actividade osteogénica de osteoblastos através da comunicação por Gap Junctions. A utilização paradigmática de matrizes de suporte para a Engenharia de Tecido Óssea tem como limitação grave a falha de fornecimento de oxigénio e nutrientes às células no interior da matriz construída levando à necrose dessas mesmas células. Além disso, a resposta do hospedeiro à implantação de corpos estranhos, como matrizes tridimensionais, tem como consequência frequente a formação de tecido fibrótico à volta do implante. A aplicação da Engenharia de cell sheets na Engenharia de Tecido ósseo tem a expectativa de ultrapassar estas limitações. Uma das estratégias exploradas teve como base a produção de cell sheets osteogénicas utilizando esta tecnologia. O potencial destas cell sheets para induzir a formação de osso foi analisada in vivo tendo sido demonstrada a formação de osso vascularizado com uma estrutura medular organizada após a implantação de uma única cell sheet num modelo de ratinho nude. Além disso, numa tentativa de promover a vascularização, foram criadas cell sheets osteogénicas co-cultivadas com células endoteliais. Estas, quando cultivadas entre cell sheets osteogénicas sobrepostas, contribuíram para a formação de novos vasos in vivo bem como para o aumento da formação de novo osso. Esta tese demonstra que monócitos/macrófagos do sangue periférico podem acelerar a diferenciação osteogénica de progenitores osteogénicos enquanto os fibroblastos exercem um efeito negativo no fenótipo osteogénico de osteoblastos. Mais ainda, no contexto de uma reacção inflamatória do hospedeiro, ficou comprovado que células da fracção mononuclear do sangue do cordão umbilical participam na formação de novos vasos após co-cultura com osteoblastos. Além disso, as células endoteliais adultas, quando combinadas com cell sheets osteogénicas, promovem a formação de osso in vivo.
Taking into consideration the complex biology of bone tissue it is quite clear that the understanding of the cellular interactions that regulate the homeostasis and regeneration of this remarkable tissue is essential for a successful Tissue Engineering strategy. The in vitro study of these cellular interactions relies on co-culture systems, a tremendously useful methodology where two or more cell types are cultured at the same time. Such strategy increases the complexity of typical monoculture systems, allowing the in vitro settings to closely mimic the in vivo environment. Moreover, 2D coculture systems have been extensively used by cell biologists to study cell interactions as an attempt to understand specific cellular mechanisms and signalling pathways. The interaction between osteoblasts/ osteoprogenitor cells and different cell types relevant within the bone Tissue Engineering context, namely mononuclear cells from peripheral blood and umbilical cord blood and fibroblasts, has been addressed in the first part of this thesis. The different co-cultures showed that mononuclear cells from peripheral blood were capable of accelerating the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by producing BMP-2. On the other hand, osteoblasts cultured on carrageenan membranes were capable of supporting the culture of endothelial progenitors cells present in the mononuclear fraction of umbilical cord blood that contributed to the in vivo angiogenesis after implantation in an inflammatory setting. Furthermore, fibroblasts, which are key players in the formation of fibrotic tissue after a biomaterial implantation, were shown to decrease the osteogenic activity of osteoblasts through gap junctional communication. A serious limitation of the paradigmatic use of scaffolds for bone Tissue Engineering is the lack of oxygen and nutrient supply to the cells in the core of the engineered construct leading to cell necrosis at the bulk of the constructs. Furthermore, foreign body response to the implanted biomaterial is a frequent reaction of the host and has as a consequence the formation of fibrotic tissue surrounding the implant. The use of cell sheet engineering for bone Tissue Engineering can potentially avoid those shortcomings. One of the explored strategies comprised the production of osteogenic cell sheets using this technology. Its potential for in vivo bone formation was analyzed and the formation of vascularized bone tissue with a marrow was originally demonstrated by implanting a single osteogenic cell sheet in a nude mice model. Furthermore, in order to promote vascularization, co-cultured osteogenic cell sheets with endothelial cells were also created. Endothelial cells, stacked in between osteogenic cell sheets, were proven to contribute to new vessel formation and increased bone formation in vivo This thesis demonstrates that monocytes/macrophages from peripheral blood can accelerate the osteogenic differentiation of osteoprogenitor cells while fibroblasts, have a deleterious effect on the osteogenic phenotype of osteoblasts. In addition, within an inflammatory host reaction, cells from the mononuclear fraction of umbilical cord blood were capable of contributing to new blood vessel formation after co-culture with osteoblasts. Moreover, when using the cell sheet technology to fabricate a bone tissue engineering construct, endothelial cells were also shown to improve in vivo bone formation. Considerando a complexa biologia do tecido ósseo torna-se claro que compreender as interacções celulares que regulam a homeostasia e regeneração deste tecido notável, é de extrema importância numa estratégia de Engenharia de Tecidos. O estudo in vitro destas interacções celulares baseia-se em sistemas de co-cultura, uma metodologia de grande utilidade onde dois ou mais tipos de células diferentes são cultivados simultaneamente e no mesmo espaço. Estes sistemas representam um aumento de complexidade, em relação aos sistemas de monocultura, que permite que as condições in vitro mimetizem melhor o ambiente in vivo. Além disso, sistemas de cultura 2D têm sido muito utilizados por biólogos no estudo de interacções celulares numa tentativa de compreender os mecanismos e vias de sinalização envolvidas. A interacção entre osteoblastos ou células osteoprogenitoras com células mononucleares do sangue periférico e do cordão umbilical, e com fibroblastos para aplicações em Engenharia de Tecido Ósseo foi estudada na primeira parte desta tese. As diferentes co-culturas permitiram mostrar que as células mononucleares do sangue periférico são capazes de acelerar a diferenciação osteogénica de células do estroma de medula óssea humana através da produção de proteína morfogenética do osso 2 (BMP-2). Por outro lado, foi também demonstrado que osteoblastos cultivados em membranas de carragenano suportam a cultura de células progenitoras endoteliais presentes na fracção mononuclear de sangue do cordão umbilical humano e que estas, por sua vez, contribuem para a angiogénese in vivo e em condições inflamatórias. Além disso, foi mostrado que fibroblastos, células-chave na deposição de tecido fibrótico após a implantação de um biomaterial, inibem a actividade osteogénica de osteoblastos através da comunicação por Gap Junctions. A utilização paradigmática de matrizes de suporte para a Engenharia de Tecido Óssea tem como limitação grave a falha de fornecimento de oxigénio e nutrientes às células no interior da matriz construída levando à necrose dessas mesmas células. Além disso, a resposta do hospedeiro à implantação de corpos estranhos, como matrizes tridimensionais, tem como consequência frequente a formação de tecido fibrótico à volta do implante. A aplicação da Engenharia de cell sheets na Engenharia de Tecido ósseo tem a expectativa de ultrapassar estas limitações. Uma das estratégias exploradas teve como base a produção de cell sheets osteogénicas utilizando esta tecnologia. O potencial destas cell sheets para induzir a formação de osso foi analisada in vivo tendo sido demonstrada a formação de osso vascularizado com uma estrutura medular organizada após a implantação de uma única cell sheet num modelo de ratinho nude. Além disso, numa tentativa de promover a vascularização, foram criadas cell sheets osteogénicas co-cultivadas com células endoteliais. Estas, quando cultivadas entre cell sheets osteogénicas sobrepostas, contribuíram para a formação de novos vasos in vivo bem como para o aumento da formação de novo osso. Esta tese demonstra que monócitos/macrófagos do sangue periférico podem acelerar a diferenciação osteogénica de progenitores osteogénicos enquanto os fibroblastos exercem um efeito negativo no fenótipo osteogénico de osteoblastos. Mais ainda, no contexto de uma reacção inflamatória do hospedeiro, ficou comprovado que células da fracção mononuclear do sangue do cordão umbilical participam na formação de novos vasos após co-cultura com osteoblastos. Além disso, as células endoteliais adultas, quando combinadas com cell sheets osteogénicas, promovem a formação de osso in vivo.
Tipo de Documento
Tese de Doutoramento
Idioma Inglês
Orientador(es) Reis, R. L.; Marques, Alexandra P.
Idioma Inglês
Orientador(es) Reis, R. L.; Marques, Alexandra P.
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