The effect of high-temperature on sugar transport in grape cells

• Autor(es): Noronha, Henrique Luis Silva de
• Data: 2010
• Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/1822/18914
• Origem: RepositóriUM - Universidade do Minho
• Tipo de Documento: Dissertação de Mestrado
• Idioma: Inglês
• Orientador(es): Gerós, H.; Paiva, Sandra

Descrição

Dissertação de mestrado em Fisiologia Molecular de Plantas Vitis vinifera is a major crop worldwide and in Portugal. Berry content in sugars, organic acids, phenolics and aroma compounds are fundamental for fruit and wine quality. These compounds are accumulated/metabolized during the development of the berry. In particular, berry sugar content is directly related to the final alcoholic content of wine, and regulates the development of its aromatic and organoleptic properties. Massive sugar accumulation in berry mesocarp occurs after véraison due to a combined action of monosaccharide (MSTs) and disaccharide transporters (DSTs). High-temperatures affect berry set and development and alter the normal sugar content of the fruit. Also, peaks of high temperature, nowadays more and more frequent, may stop the ripening progress. We have been exploring the mechanisms involved in sugar import and compartmentation into the berry. VvHT1 (Vitis vinifera Hexose Transporter 1) is a high affinity plasma membrane H+-dependent symporter with broad specificity for monosaccharides abundant at early stages of berry development. The expression of this transporter is tightly regulated by sugars at transcriptional and post-translational levels. In the present study we aimed at the elucidation of the effect of high temperature and temperature fluctuations on sugar transport in grape cells. Results showed that a temperature treatment of 38ºC for 12 h decreased by 40% the Vmax of 14C-glucose transport in CSB (Cabernet Sauvignon Berry) cells. Contrarily, abscisic (ABA) and salicylic acid (SA) stimulated sugar uptake by 28.7% and 62.5%, respectively. ABA and SA also stimulated 14C-glucose accumulation in intact grape berries by 88.7% and 67.8%, respectively. The downregulation of glucose uptake mediated by high temperature corroborated the observed decrease of the VvHT1 levels in the plasma membrane. Moreover, after hightemperature treatment the intracellular ROS levels and lipid peroxidation increased by 97% and 29%, respectively. Proteomic analysis of the plasma membrane of CSB cells, allowed the identification of several proteins up-regulated in response to high temperature. It is hypothesised that intracellular ROS levels can mediate this cellular response to high-temperature. To study the recycling and turnover of VvHT1 in response to high-temperature a VvHT1-GFP expression clone was produced and a protocol for transient protoplast transfection is currently being optimized. A videira (Vitis vinifera) é uma espécie agrícola de elevada importância ao nível mundial e em Portugal. O conteúdo do bago em açúcares, ácidos orgânicos, compostos fenólicos e aromáticos determina a qualidade final do fruto e do vinho. Estes compostos são acumulados/metabolizados durante o desenvolvimento do fruto. O conteúdo do bago em açúcares condiciona o teor alcoólico do vinho, além de regular o desenvolvimento das suas propriedades aromáticas e organolépticas. A acumulação massiva de açúcares que ocorre no mesocarpo após a fase de pintor (véraison) resulta da acção combinada de transportadores membranares de mono (MST) e de dissacarídeos (DST). Temperaturas elevadas podem afectar a frutificação e o desenvolvimento do bago, bem como alterar o seu conteúdo normal em açúcares. Adicionalmente, picos de temperatura, muito frequentes no contexto das modificações climáticas em curso, podem comprometer o processo de amadurecimento. O nosso grupo de investigação tem dedicado atenção particular ao estudo dos mecanismos envolvidos no transporte e compartimentação de açúcares no bago. O transportador da membrana plasmática VvHT1 (Vitis vinifera Hexose Transporter 1), expresso nas fases iniciais do desenvolvimento do bago, medeia a incorporação da glucose e de outros monossacarídeos por um mecanismo de simporte com H+. A expressão deste transportador é finamente regulada pelo teor em açúcares ao nível transcricional e pós-transcricional. No presente trabalho foi estudado o efeito de temperaturas elevadas, e de flutuações de temperatura, no transporte de açúcares em células de videira. Os resultados demonstram que um pico de temperatura de 38ºC aplicado durante 12 h reduz em 40% a Vmax de transporte da 14C-glucose em culturas celulares (CSB, Cabernet Sauvignon Berry). Contrariamente, o ácido abcísico (ABA) e o ácido salicílico (SA) estimularam o transporte de açúcar em 28,7% e 62,5%, respectivamente. O ABA e o SA também estimularam a incorporação de 14C-glucose em bagos intactos em 88,7% e 67,8%, respectivamente. A repressão do transporte da glucose causada por temperaturas elevadas correlacionou-se com a detecção de níveis diminuídos do VvHT1 na membrana plasmática. Adicionalmente, a exposição a elevadas temperaturas aumentou os níveis intracelulares de ROS e de peroxidação lipídica em 97% e 29%, respectivamente. Uma análise de proteómica efectuada em membranas plasmáticas de células CSB, permitiu a identificação de diversas proteínas especificamente expressas em resposta a temperaturas elevadas. É discutido que o aumento observado dos níveis intracelulares de ROS podem mediar esta resposta celular a elevadas temperaturas. No sentido de estudar a reciclagem e turnover do transportador VvHT1 em resposta a temperaturas elevadas, foi construído um clone de expressão VvHT1-GFP e optimizado um protocolo de transformação de protoplastos.