Autor(es):
Ribeiro, Diana Margarida da Costa 
Data: 2010
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/1822/15963
Origem: RepositóriUM - Universidade do Minho
Assunto(s): Catharanthus roseus; Arabidopsis; Protoplasts; PEG-mediated transformation; Agroinfiltration; GFP fusions; Subcellular localization; Secretory pathway; Sorting signals; Vacuole; Confocal microscopy; Transformação mediada por PEG; Agroinfiltração; fusões-sGFP; Localização subcelular; Via secretora; Sinais de direccionamento; Vacúolo; Microscopia confocal
Descrição
Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-Empreendedorismo em Plantas Aromáticas e Medicinais Nowadays, the availability of much gene sequence information demands the
development of tools for their fast characterization at the protein level, where function
actually resides. Here, the interest in the characterization of certain of the known
Arabidopsis class III peroxidase (Prx) genes, as well as the interest in the
characterization of candidate genes implicated in the metabolism of the anticancer
terpenoid indole alkaloids of Catharanthus roseus, has led to the need of establishing
transient expression procedures for these two species.
Therefore, the main goal of this work was the development and optimization of
simple/fast, efficient and reproducible transient expression protocols for subsequent
subcellular localization studies of proteins coded by Prx genes, and for characterization
of candidate genes provided from omic approaches, namely implicated in the regulation,
biosynthesis or transport of the valuable alkaloids from C. roseus. A complementary
goal was to investigate the subcellular localization and sorting determinants of Prxs,
namely the vacuolar sorting capacity of a C-terminal amino acid sequence extension
(CTE) present in vacuolar Prxs, using as examples the well characterized and most
abundant vacuolar Prx from C. roseus leaves, CrPrx1, and the most abundant Prx in the
leaves of Arabidopsis, AtPrx34. For this, already available CrPrx1-GFP fusions and
newly generated AtPrx34-GFP fusions were used in the transient expression assays.
The successful establishment of protocols for PEG-mediated transformation of
both Arabidopsis and C. roseus mesophyll protoplasts was achieved and validated as
excellent transient expression systems. Transient expression by Agrobacterium
infiltration of Arabidopsis and C. roseus leaves was also attempted, but it was only
successful with in vitro C. roseus plants. However, promising insights were made into
the development of this technique.
Expression of CrPrx1-GFP fusions in Arabidopsis and C. roseus protoplasts using
the established protocols confirmed the vacuolar localization of this Prx. Additionally
the CrPrx1 signal peptide (SP) and CTE were confirmed as sorting determinants that
target GFP to the ER and vacuole, respectively. The characterization of the subcellular localization and sorting determinants of AtPrx34 was not elucidated, possibly due to
malfunctioning of the vector plasmid used for protoplast infiltration. In fact, upon
agroinfiltration of in vitro C. roseus plants, it was possible to observe sorting to the ER
of an SPAtPrx34-GFP fusion coded by a construct harboured in a binary vector plasmid,
different from the one used for protoplast transformation. Thus, a resolution of the
subcellular sorting of AtPrx34 should be possible in the near future.
The transient expression assays described in the present study were highly
reproducible, resulted in very satisfactory transformation efficiencies, and constitute a
reliable and inexpensive methods that can be performed in most labs, and that are
suitable test-systems to characterize genes of unknown function. This is also the the first
time a transient expression system for C. roseus protoplasts is reported, using a PEGmediated
transformation protocol. Actualmente, a disponibilidade de inúmeras sequências genómicas exige o
desenvolvimento de ferramentas para uma rápida caracterização ao nível protéico, onde
de facto reside a função. Neste trabalho a caracterização de determinados genes de
Peroxidases de Classe III (Prx) de Arabidopsis, assim como o interesse na
caracterização de possíveis genes envolvidos no metabolismo de alcalóides indólicos
terpenóides anticancerígenos de Catharanthus roseus, impulsionou a necessidade de
estabelecer procedimentos de expressão transiente para estas duas espécies.
Consequentemente, o objectivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento e
optimização de protocolos de expressão transiente simples/rápidos, eficientes e
reproduzíveis para estudos de localização subcelular de proteínas codificados por genes
Prx, e para a caracterização de possíveis genes obtidos de abordagens omicas,
nomeadamente implicados na regulação, biossíntese ou transporte de alcalóides
relevantes de C. roseus. Como objectivo complementar investigar a localização
subcelular e sinais de direccionamento de Prxs, designadamente a capacidade de
direccionamento vacuolar da extensão C-terminal aminoacídica (CTE) presente em Prxs
vacuolares, utilizando como exemplos a Prx vacuolar mais abundante e estudada
presente nas folhas de C. roseus, Crprx1, e a Prx mais abundante nas folhas de
Arabidopsis, AtPrx34. Para tal, fusões CrPr1-GFP já disponíveis e fusões AtPrx34-GFP
recém geradas foram utilizadas em procedimentos de expressão transiente.
O estabelecimento com sucesso de protocolos de transformação mediada por
PEG para protoplastos de mesófilo de Arabidopsis e C. roseus foi alcançado e validado
como um excelente sistema de transformação transiente. Transformação transiente por
infiltração com Agrobacterium de folhas de Arabidopsis e C. roseus foi abordado, mas
apenas foram obtidos resultados positivos com plantas de C. roseus in vitro. Todavia
progressos promissores foram realizados para o desenvolvimento desta técnica.
Expressão de fusões CrPrx1-GFP em protoplastos de Arabidopsis e C. roseus
utilizando os protocolos estabelecidos confirmaram a localização vacuolar desta Prx.
Adicionalmente o péptido sinal (SP) e a extensão C-terminal (CTE) de CrPrx1 foram confirmados com sinais determinantes que direccionam a GFP para o RE e o vacúolo,
respectivamente. A caracterização da localização subcelular e sinais de direccionamento
de AtPrx34 não foram elucidados, possivelmente devido a uma irregularidade funcional
do vector plasmídeal utilizado na transformação de protoplastos. De facto, após
agroinfiltraçao de plantas C. roseus in vitro, foi possível observar o direccionamento
para o RE da fusão SPAtPrx34-GFP codificada por um constructo incluído em vector
binário, diferente do vector utilizado na transformação de protoplastos. Portanto, a
caracterização do direccionamento subcelular da AtPrx34 poderá ser possível num
futuro próximo.
Os procedimentos de expressão transiente descritos no presente estudo
manifestaram-se bastante reproduzíveis, resultando em níveis satisfatórios de eficiência
de transformação, e constituem métodos fidedignos e de baixo custo que podem ser
realizados na maioria dos laboratórios, e são sistemas-teste convenientes para
caracterizar genes de função desconhecida. Foi também reportado pela primeira vez um
sistema de transformação transiente em protoplastos de C. roseus, utilizando um
protocolo de transformação mediada por PEG.
Palavras-chave: Catharanthus roseus, Arabidopsis, transformação mediada por PEG,
Agroinfiltração, fusões-sGFP, localização subcelular, via secretora, sinais de
direccionamento, vacúolo, microscopia confocal.
