Author(s):
Pina, Lígia Marisa Sampaio, 1990- 
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9647
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Engenharia genética; Recombinação genética; Transcrição genética; Teses de mestrado - 2013
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 Genome engineering is currently entering the phase of genetic manipulation in vivo. Several important discoveries have made this progress possible, such as the development of site-specific recombinases (SSRs) and the discovery of TAL effector (TALE) proteins a novel type of DNA-binding proteins. SSRs have proved to be reliable and widely used engineering tools to manipulate DNA in vitro and in vivo. They posses unique ability to mediate efficient and precise integration, deletion or inversion of defined DNA segments. Hyperactivated variants of the resolvase/invertase family of serine recombinases do not required accessory factors for recombination. Thereby they can be re-targeted to sequences of interest by replacing native DNA-binding domains (DBDs) with engineered TALE proteins, generating a chimeric TALE recombinase (TALER) with programmable sequence specificity. Here we described a chimeric TALE recombinase assembled in order to mediate site-specific recombination on novel sequences. We engineered a fusion between a hyperactivated catalytic domain from the Tn3 resolvase and a functional DBD assembled utilizing the customized TALE design. We use three different truncated TALE variants to generate diverse TALER constructs and six different target sites. TALE domain was assembled and tested beforehand through its fusion with a nuclease protein. We have shown that TALE DNA-binding domain works efficiently and when fused to a nonspecific cleavage domain is able to introduce DNA strand breaks at specific genomic sequence in human cells. We also show that current designs of TALERs did not mediate site-specific recombination on the predicted target sites when tested in bacterial cells. We discuss some reasons that might be relevant for the obtain results. Although TALER fusions described herein did not produce a functional variant. This work demonstrates that further optimization of several technical details can be made. The creation of novel recombinases domains promises significantly expanding the targeting capacity of engineered recombinases in genome engineering and even gene therapy treatments. A engenharia genómica encontra-se a entrar numa fase de manipulação genética in vivo. Diversas descobertas foram feitas de forma a tornar possível este progresso, tais como, o desenvolvimento das recombinases sítio-específicas (SSRs) e a descoberta das proteínas TAL-effector (TALE), um novo tipo de proteínas de ligação ao DNA. As recombinases sítio-específicas demonstraram ser viáveis quando usadas como ferramentas para a manipulação do DNA in vitro e in vivo. Estas recombinases possuem qualidades únicas para mediar de forma eficiente e precisa a integração, deleção ou inversão de segmentos de DNA. Variáveis hiperativadas de resolvases/invertases da família das serina recombinases não requerem factores acessórios para a recombinação. Deste modo, podem ser redirecionados para sequências de interesse através da troca do domínio de ligação ao DNA (DBD), por uma proteína TALE, originando, uma recombinase quimérica (TALER) com especificidade programada para uma sequencia alvo. Neste trabalho é descrita uma recombinase quimérica TALE construída de forma a mediar a recombinação sítio-específica em novas sequencias. Nós promovemos a fusão entre um domínio catalítico hiperativo da resolvase Tn3 com um domínio funcional de ligação ao DNA, utilizando um design TALE customizado. Foram desenhadas três variantes truncadas da proteína TALE, para gerar diversos TALERs, e seis locais alvo diferentes. O domínio TALE foi construído e testado em antemão através da sua fusão com uma proteína nuclease. Foi demonstrado que o domínio TALE de ligação ao DNA quando acoplado a um domínio de clivagem não específico trabalha, eficientemente, de forma a introduzir quebras de cadeia dupla em células humanas. Também demonstramos que os TALERs correntemente utilizados, não foram capazes de mediar recombinação sítio-específica nos locais alvos preditos quando testados em células bacterianas. Nós discutimos algumas das razões que podem ser relevantes para os resultados obtido. Embora, as fusões TALER descritas neste trabalho não resultaram numa variante funcional. Este trabalho demonstra que uma optimização de diversos detalhes técnicas pode ser feita. A criação de novas recombinases quiméricas promete expandir significativamente a capacidade do direcionamento das recombinases em áreas como a engenharia genómica e tratamentos de terapia génica.
Document Type
Master Thesis
Language
English
Advisor(s)
Gomes, Rui Artur Paiva Loureiro, 1958-; Buchholz, Frank
