Autor(es):
Martins, Ana Filipa Moreira, 1987- 
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/6581
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Microbiologia; Campylobacter; Gastroenterite; Resistência a antibióticos; Fenótipo; Genótipo; Teses de mestrado - 2011
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 In 2008 the European Food Safety Authority, EFSA, reported that Campylobacter was one of the most frequently observed bacterial gastrointestinal pathogen in humans. Poultry meat is an extremely important foodborne source of Campylobacter spp. Although self-limiting, campylobacteriosis occasionally requires treatment and macrolides and fluoroquinolones are the drugs of choice. For the past few decades resistant C. jejuni and C. coli strains have emerged at an alarming rate due, at least partly, to the large-scale use of these agents in food production animals and passed on to humans through poultry meat products. The purpose of this work was the phenotypic and genotypic characterization of isolates from two different origins: poultry and human, in order to perceive the general panorama regarding antimicrobial resistance for C. jejuni and C. coli strains in Portugal. Disc diffusion tests results provided comprehensive information about antimicrobial resistance for the tested products and made selection of multiple drug resistant strains possible. Antibiotic and disinfectant minimum inhibitory concentrations were determined and the effect an efflux pump inhibitor in restoring ciprofloxacin susceptibility was analyzed. High resistance frequency to fluoroquinolones was observed reaching, for ciprofloxacin, levels as high as 92% (retail isolates), 30% to 40% of studied isolates were erythromycin resistant and resistance patterns for tetracycline ranged from 37% to 91%. Human isolates showed high level percentage of resistant isolates to both therapeutic alternatives. Multiple drug resistance was one of the major issues to be considered in the present work, which occurred in 86.3% to 93.2% of tested strains. Erythromycin and ciprofloxacin high level resistance (HLR) strains were among the selected isolates, and the respective HLR associated point mutations, were detected. The effect of the efflux pump inhibitor (PAβN) on ciprofloxacin resistance revealed that susceptibility to this antibiotic could be restored for mostly all, except for HLR ciprofloxacin strains. Campylobacter spp. é reconhecido como um dos principais agentes responsáveis por gastroentrites de etiologia bacteriana em humanos. Entre as espécies deste género patogenicamente mais relevantes incluem-se Campylobacter jejuni e Campylobacter coli sendo que a primeira é responsável por cerca de 80 - 90% dos casos de campilobacteriose registados, enquanto os restantes casos são, na sua maioria, da responsabilidade de C. coli (Fitzgerald et al., 2008). Tipicamente os casos de campilobacteriose são auto-limitantes e não requerem terapêutica antimicrobiana. Esta é apenas efectivamente necessária num relativamente reduzido número de situações: Caso a infecção ocorra em indivíduos imunocomprometidos, na eventualidade de se verificarem complicações secundárias extra intestinais ou em caso de persistência dos sintomas gastrointestinais (Nachamkin et al., 1998; Skirrow et al., 2000). Os macrólidos e fluoroquinolonas surgem como os principais agentes terapêuticos indicados na resolução das situações anteriormente descritas. A resistência a estes agentes terapêuticos tem, no entanto, crescido a um ritmo alarmante nas últimas décadas verificando-se inclusivamente resistências simultâneas a diferentes grupos de antibióticos por parte de estirpes isoladas numa das principais fontes de infecção como sucede com a carne de aves (Vliet & Ketley, 2001; Gibreel et al., 2006). Os macrólidos são antibióticos bacterioestáticos que actuam por inibição da síntese proteica ligando-se à subunidade 23S rARN da subunidade ribossomal 50S, onde, perante a ocorrência de mutações pontuais, se verifica a alteração do alvo deste agente terapêutico inibindo assim a sua actividade. Estas mutações ocorrem ao nível do domínio V do gene 23S rARN, nas posições 2075 e 2074 ocorrendo, de forma geral, respectivamente uma transição (A2075G) e uma transversão (A2074C). Tipicamente esta primeira mutação pontual é predominante e será por isso um dos alvos neste estudo (Engberg et al., 2001; Gibreel & Taylor, 2006). As fluoroquinolonas são agentes antimicrobianos de largo espectro que actuam por inibição das topoisomerases. No caso de Campylobacter spp. é particularmente importante o seu efeito na topoisomerase II, ADN girase responsável pela manutenção do supercoil negativo da dupla hélice da molécula de ADN durante a replicação e transcrição. A ocorrência de uma mutação pontual ao nível da região determinante de resistência a quinolonas (QRDR, do ing. Quinolone Resistance Determining Region) afectando o aminoácido 86Thr (Thr-Ile), é o principal mecanismo de desenvolvimento de resistência a fluoroquinolonas. Não existem actualmente evidências da existência da topoisomerase IV em Campylobacter (Engberg et al., 2001; Fàbrega et al., 2008). Para além da ocorrência de mutações pontuais observa-se o desenvolvimento de resistência, tanto a fluoroquinolonas como a macrólidos devido à actividade de mecanismos de efluxo. A bomba de efluxo CmeABC pertencente à família de transportadores RND (do ing. Resistance Nodulation Division), inicialmente descrita por Pumbwe e Piddock (2002) e Lin et al. (2002) encontra-se actualmente associada a mecanismos de resistência intrínseca e a baixos nível de resistência, LLR (do ing. Low Level Resistance) a estes agentes terapêuticos. A actividade da bomba de efluxo é inibida na presença do inibidor de bombas de efluxo, EPI (do ing., efflux pump inhibitor) (Webber & Piddock, 2003; Akiba et al., 2006; Piddock, 2006). O aumento de estirpes que apresentam resistência múltipla é actualmente uma relevante fonte de preocupação sob o ponto de vista clínico, sendo necessário determinar se a resistência apresentada por estirpes de origem animal se estende a outros antimicrobianos, nomeadamente desinfectantes uma vez que estes são utilizados frequentemente nos programas de higienização de matadouros, nas salas de desmancha de onde provêem as carcaças e peças de frango para consumo humano. O objectivo deste trabalho prendia-se com a caracterização fenotípica e genotípica de isolados de Campylobacter de diferentes origens, amostras de produtos para consumo humano e amostras com origem em pacientes com campilobacteriose, de forma a captar o estado actual deste importante agente em relação a resistências a antimicrobianos tanto na carne para consumo humano como no próprio homem, em Portugal. Pretendia-se igualmente avaliar a resposta dos isolados a dois desinfectantes diferentes, utilizados rotineiramente na limpeza e desinfecção dos matadouros e salas de desmancha. Por fim era também pretendido apreciar o efeito de um inibidor de bomba de efluxo, PAβN (fenilalanina arginina β-naftilamida) no restabelecimento da susceptibilidade, neste caso especifico, à ciprofloxacina. Tendo por base os objectivos descritos foram seguidas as metodologias que se consideraram mais adequadas. A identificação dos isolados foi inicialmente feita pelo teste do hipurato e posteriormente corroborada por PCR multiplex, de acordo com Dennis et al. (1999) e Samorsornsuk et al. (2007). Testes de susceptibilidade a antibióticos por difusão de disco foram realizados, de modo a proceder à elaboração dos perfis de resistência dos isolados obtidos, provenientes de amostras de frangos (pele do peito, intestino e peito de frangos de produção extensiva indoor, intensiva e biológica e de carcaças de frangos ‘pronto a cozinhar’ adquiridas em grandes superfícies comerciais) para 11 antibióticos, eritromicina, tetraciclina, gentamicina, amoxacilina e ácido clavulânico, ácido nalidixíco, ciprofloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trimetropim-sulfametoxazole, cloranfenicol e ampicilina. A selecção de estirpes com resistência múltipla era então possivel. Ás estirpes seleccionadas for aplicada a técnica de concentração mínima inibitória, CMI, por diluição em agar, para eritromicina, ciprofloxacina, tetraciclina e gentamicina, assim como para os dois desinfectantes: hipoclorito de sódio e cloreto de benzalcónio. A gama de concentrações para os antibióticos está de acordo com o normativo CA-SFM 2010. A gama de concentrações a que os desinfectantes foram testados variou entre 0,5 a 32 μg/mL, de acordo com Peyrat et al. (2008). A ocorrência de mutações pontuais, nomeadamente à mutação A2075G que surge ao nível do domínio V do gene responsável pela subunidade 23S rRNA, tipicamente perdominante em comparação à ocorrência da mutação A2074C na mesma região foi testada recorredo-se á técnica de RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism) de acordo com Kurinčič et al., 2007. As mutações pontuais ao nível da região QRDR do gene responsável pela DNA girase, gyrA foram avaliadas pela técnica de MAMA-PCR (Mismatch Amplification Mutation Assay) de acordo com o trabalho de Payot et al. (2004). O efeito da bomba de efluxo foi avaliado na presença de diferentes concentrações de ciprofloxacina e de diferentes concentrações de inibidor, PAβN (Phe-Arg-β-naftilamida) realizado de acordo com o estudo descrito por Payot et al. (2004). Do numero total inicial de isolados, 75% tinham origem alimentar enquanto que os restantes tinham origem humana. Do número inicial de isolados, 258, 43% foram identificados como C. jejuni enquanto os restantes 57% foram identificados como C. coli. Testes de difusão de disco providenciaram a informação necessária, relativamente à resistência a antibióticos, para os produtos testados. Foi possível constatar uma particular elevada frequência de resistência às fluoroquinolonas, 58% a 92%. Para o macrólido eritromicina, 30% a 40% dos isolados estudados eram resistentes. Foram também identificados níveis de resistência para a gentamicina e tetraciclina que variavam respectivamente entre: 6% a 45% e de 37% a 91%. Isolados com origem em amostras de frangos de produção extensiva apresentaram, comparativamente aos isolados com origem em amostras de frangos de produção biológica, níveis mais baixos de resistência a ciprofloxacina enquanto os isolados de amostras de produtos prontos a cozinhar apresentavam os mais altos níveis de resistência a este antibiótico. O mesmo padrão de resistência foi observado para a tetraciclina onde se evidenciaram níveis de resistencia mais reduzidos para os isolados com origem em frangos de produção extensiva e os mais altos para isolados de amostras de produtos prontos a cozinhar. No caso especifico da eritromicina foi possível constatar, que os isolados de produtos prontos a cozinhar apresentavam-se mais susceptíveis (40% de isolados resistentes) que os isolados de frangos de produção extensiva (75% de isolados resistentes). Os isolados de amostras de fezes humanas provenientes de indivíduos com campilobacteriose apresentavam níveis de resistencia particularmente elevados para as alternativas terapêuticas tipicamente utilizadas: 32% e 37% dos isolados eram resistentes respectivamente a eritromicina e à tetraciclina e mais de 70% eram resistentes à ciprofloxacina. Apenas 19% dos isolados apresentavam resistência a gentamicina, no entanto, devido à elevada toxicidade deste agente a sua aplicação é altamente limitada mas persiste enquanto alternativa terapêutica. A questão da resistência múltipla era um ponto fulcral no desenvolvimento desta dissertação. Foi possível observar que para todos os isolados testados a maioria apresentava resistência para 4 ou mais das 7 classes de antibióticos testadas, tipicamente para quinolonas, macrólidos, tetraciclina e β-lactâmicos. Constatou-se que entre 86% e 93% das estirpes testadas apresentavam resistencia múltipla. Estirpes de origem humana e de origem em produtos prontos a cozinhar não apresentaram nenhuma estirpe totalmente susceptível a todas as classes de antibióticos testadas. Todas as estirpes avaliadas como HLR para a ciprofloxacina e eritromicina eram portadoras das mutações pontuais, respectivamente gyrA (Thr86) e A2075G. As concentrações mínimas inibitórias mais altas foram obtidas para estirpes de origem em frangos de produção biológica. Para a eritromicina foi de 128 mg/L e de 512 mg/L para a ciprofloxacina. Foi também possível constatar algum paralelismo entre estirpes classificadas como HLR para a ciprofloxacina e os padrões de resistencia obtidos para os desinfectantes em estudo. As mais elevadas concentrações mínimas inibitórias foram de 64 mg/L para o cloreto de benzalcónio e de 512 mg/L para o hipoclorito de sódio. É relevante mencionar que as estirpes com origem em produtos prontos a cozinhar estudadas, apresentavam-se totalmente resistentes à actividade do hipoclorito de sódio. Relativamente ao funcionamento da bomba de efluxo e à actividade do respectivo inibidor foi possível constatar que tipicamente a presença do inibidor devolvia inteiramente, até a concentração máxima de 40 mg/L, a susceptibilidade à ciprofloxacina. Para as estirpes classificadas como HLR, no entanto, a resistência a ciprofloxacina persistiu mesmo perante a concentração de inibidor mais alta testada: 120 mg/L. È actualmente inquestionável a necessidade crescente de melhor compreender o processo subjacente ao desenvolvimento de resistências a antimicrobianos. O uso inadequado destes compostos levou ao aparecimento disseminado de estirpes resistentes associado a padrões de resistencia múltipla indicando a rápida perda de eficácia dos agentes actualmente disponíveis no tratamento de infecções em humanos. A necessária introdução de mecanismos de regulação e controlo deverá ser feita paralelamente à combinação de informações epidemiológicas disponíveis num contexto mundial em que Portugal não será a excepção.
