Autor(es):
Veiga, Ana Salomé Rocha do Nascimento, 1980- 
Data: 2007
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/1698
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Biofísica molecular; Teses de doutoramento
Descrição
Tese de doutoramento em Bioquímica (Biofísica Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008 The HIV-1 envelope glycoprotein complex plays an important role in viral entry. Its surface subunit gp120 is responsible for virus binding to cellular receptors, and the transmembrane subunit gp41 mediates fusion of the virus with the target cell. Different functional regions can be identified in gp41, each one with importance in the fusion process. T20 and T-1249 are two HIV-1 fusion inhibitor peptides, being T20 already approved for clinical application in AIDS treatment. The work here presented describes research on the role of biomembranes on their mode of action. A model for the role of biomembranes was proposed. Given the similarities between the HIV-1 and SARS-CoV, and the urgency to obtain licensed drugs to treat SARS, the possibility that T20 and T-1249 can work as SARS- CoV inhibitors was investigated. The results obtained show that despite the hypothesis that T20 could inhibit SARS-CoV fusion is correct, the effect may not be strong enough for practical application. A small sequence inside the HIV-1 gp41 ectodomain membrane proximal region (MPR) is commonly referred to as a cholesterol binding domain. As the MPR plays a key role in the HIV-1 fusion process and the viral envelope is rich in cholesterol, the influence of cholesterol on the interaction of the MPR derived peptides with membrane model systems was studied. 2F5 and 4E10 are two potent and broadly neutralizing antibodies against HIV-1, whose epitopes are localized in the gp41 MPR. It was proposed that these antibodies can interact with the viral membrane trough a hydrophobic surface present on their third complementarity-determining region of the heavy chain. The 2F5 and 4E10 interactions with biomembranes models, in the absence and presence of its epitopes, were investigated in order to reveal the membranes role in the antibodies mechanism of action. O vírus da imunodeficiência humana (VIH) é o agente causador do síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e o seu modo de actuação consiste, sobretudo, em infectar e destruir células T CD4 do organismo hospedeiro. Existem dois tipos do + vírus, VIH-1 e VIH-2, mas é o VIH-1 o mais virulento e o responsável pela maior parte dos casos de SIDA no mundo. O envelope do vírus consiste numa bicamada lipídica, derivada da célula hospedeira, que possui um complexo glicoproteíco que confere ao vírus a capacidade para entrar nas células alvo. Este complexo é formado pelas subunidades gp120 (subunidade superfície) e gp41 (subunidade transmembranar), que se mantêm associadas de modo não covalente e oligomerizam sob a forma de trímeros na superfície do vírus. A gp41 é uma proteína transmembranar constituída por um domínio extracelular (ectodomínio), um domínio transmembranar e um domínio intracelular (endodomínio). O ectodomínio da gp41 contém várias regiões funcionais importantes para o processo de fusão viral. O péptido de fusão, localizado no terminal N da proteína, é uma região hidrófoba e rica em resíduos de glicina. Este domínio é essencial para o processo de fusão, nomeadamente para a penetração inicial da membrana da célula alvo. No seguimento do péptido de fusão encontram-se duas regiões que têm tendência para formar superenrolamentos de hélice a. A região adjacente ao péptido de fusão é chamada NHR e a região CHR é a que precede o segmento transmembranar. Os péptidos derivados destas regiões são chamados péptidos N- e C-, respectivamente. No terminal C da proteína, entre a região CHR e o domínio transmembranar, situa-se a chamada região próxima da membrana (MPR membrane proximal region). Esta região é rica em resíduos de triptofano e parece ter também um papel chave na fusão viral. O primeiro passo no processo de infecção consiste na ligação da gp120 ao receptor (CD4) e co-receptores (CXCR4 ou CCR5) na superfície das células alvo. Esta interacção induz alterações conformacionais na gp120 e modula as interacções gp120/gp41. A gp41 sofre então uma alteração conformacional e a sua estrutura nativa transita para uma estrutura intermediária de pré- hairpin . Estas variações na gp41 incluem a exposição do péptido de fusão e a sua inserção na membrana alvo. Posteriormente dá-se uma associação entre as regiões NHR e CHR levando à formação da estrutura em hairpin (trímero em dímeros de hélices antiparalelas), activa para afusão, o que leva à aproximação das membranas celular e viral. Na estrutura em hairpina região NHR forma três hélices centrais arranjadas num superenrolamento trimérico,enquanto que a região CHR for ma três hélices exteriores que encaixam de um modoantiparalelo em cavidades hidrófobas na superfície do superenrolamento. O que ocorredesde a aproximação das membranas até à fusão completa não está clarificado masparece envolver a formação de agregados dos trímeros da proteína do envelope paraformar poros de fusão.O tratamento mais comum para os doentes com SIDA baseia-se na aplicação decombinações de drogas anti-VIH, nomeadamente inibidores do transcriptase reversa edo protease, dois enzimas virais com importância ao nível da replicação do vírus.Apesar dos benefícios do uso destas drogas, a sua utilização é limitada devido os seusefeitos tóxicos e aparecimento de estirpes resistentes. Assim, tornou-se óbvia anecessidade de desenvolvimento de drogas mais eficientes, menos tóxicas e quepermitam eliminar os efeitos adversos associados à acção das drogas no interior dascélulas.Do trabalho científico desenvolvido nos últimos anos, resultaram fármacos que têmcomo objectivo actuar ao nível da entrada do vírus nas células, nomeadamente, naligação da gp120 ao CD4, na ligação da gp120 aos co-receptores e na fusão do envelopedo vírus com a membrana alvo. Apesar da enorme quantidade de compostos emdesenvolvimento e até em fase de testes clínicos, o T20 (também chamado Enfuvirtideou pelo nome comercial da marca Fuzeon), um inibidor de fusão, é o único já aprovadopara aplicação clínica. No entanto, apesar da sua comprovada eficácia clínica, não háconsenso sobre o seu modo de actuação ao nível molecular. O mecanismo de acçãomais aceite envolve a interacção do T20 com a região NHR da gp41, na fase de pré-hairpin , impedindo a formação da estrutura em hairpin e deste modo a fusão viral coma membrana celular.As membranas biológicas são entidades complexas, constituídas principalmente porlípidos e proteínas, que limitam as células, constituindo uma barreira entre o meioexterior e interior. A base estrutural das biomembranas é a bicamada lipídica. Noentanto, a distribuição lipídica nas biomembranas pode ser assimétrica levando a que asduas camadas tenham uma composição lipídica diferente. Além disso, apesar de grandeparte dos lipídos na bicamada formarem uma mistura uniforme e homogénea nachamada fase fluida, podem ocorrer heterogeneidades laterais, ou domínios, comcomposições lipídicas distintas. Os rafts lipídicos, são domínios encontrados nasmembranas plasmáticas que são enriquecidos em colesterol e esfingolípidos. Estesdomínios existem numa fase de líquido ordenado que é mais ordenada e compacta que oresto da bicamada, em fase fluida. Tem sido proposto que os rafts podem funcionarcomo plataformas para a reunião de complexos macromoleculares associados amembranas com importância ao nível de vários processos celulares, entrada de víruscomo o VIH-1 para as células (uma vez que receptores e co-receptores se encontramprovavelmente associados a rafts ) e a formação de vírus a partir da célula infectada. Deresto, a membrana deste vírus é muito enriquecida em colesterol e esfingolípidos,relativamente aos níveis encontrados nas membranas das células alvo, sendo sugeridoque isso se deve ao facto de a formação dos novos vírus se fazer através de raftslipídicos. O colesterol possui um papel central uma vez que mantém os rafts num estadofuncional.O estudo da interacção entre péptidos e/ou proteínas e biomembranas é muitas vezesnecessário de modo a clarificar alguns processos em que ambos estejam envolvidos. Noentanto, as membranas biológicas são sistemas demasiado complexos para serem usadascomo tal neste tipo de estudo. Uma alternativa viável é o estudo destas interacções emsistemas modelo de membranas, nomeadamente vesículas lipídicas unilamelares.Podendo ser preparadas em diferentes tamanhos, foram no presente trabalho utilizadosna sua maioria vesículas unilamelares grandes com diâmetro aproximado de 100 nm.Estes sistemas miméticos de membranas biológicas permitem uma base de estudosimplificada em simultâneo com a manutenção das principais propriedades dasbiomembranas.Os estudos realizados ao longo deste trabalho foram essencialmente biofísicos,baseados em técnicas de espectroscopia de fluorescência, dado o facto de os péptidos eproteínas estudados serem intrinsecamente fluorescentes sem necessidade deacoplamento de sondas.O T20, um péptido sintético que corresponde a uma sequência linear da gp41 doVIH-1 (entre o terminal C da região CHR e o terminal N da MPR), é um potenteinibidor da fusão deste vírus. Apesar de estar aprovado para uso clínico, não existeainda consenso acerca da sua acção ao nível molecular. Investigou-se a possívelexistência de um papel para as membranas lipídicas no modo de acção do T20, sendoque este envolvimento é sugerido tanto pela estrutura secundária do péptido, como por
