Autor(es):
Tavares, Joana Alexandra Pinto da Costa 
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10216/10804
Origem: Repositório Aberto da Universidade do Porto
Assunto(s): Bioquímica; Biochemistry; Porto
Descrição
Leishmaniasis is a parasitic disease, caused by the protozoa of the genus
Leishmania that affects millions of people worldwide, especially in tropical and
subtropical areas, and is responsible for high mortality and morbidity. Disease
control is dependent on drug therapy, since no approved human vaccine is
available. However, the existing therapy is far from satisfactory owing to the
emergence of resistances, toxicity and its limited efficacy due to disease
exacerbation, mainly associated with compromised immune capability.
The proteins belonging to the Silent Information Regulator 2 (SIR2) family, also
known as Sirtuins are conserved throughout evolution and are classified as class III
histone deacetylases (HDAC) due to their dependency on NAD+ to deacetylate
lysine residues of histones and non-histone substrates. Moreover, these proteins
have been involved in the regulation of a number of biological processes such as
gene silencing, DNA repair, longevity, metabolism, apoptosis, and development.
One of the three SIR2 homologues identified in the Leishmania genome, the
SIR2RP1, is localized in the cytosol and, according to indirect molecular as well as
biological approaches, seems to be involved in parasite survival. A genetic approach
through the disruption of the Leishmania SIR2RP1 encoding gene suggested that
this protein was determinant to parasite survival due to the impossibility of
generating null chromosomal mutants without episomal rescue. Furthermore,
disruption of one LiSIR2RP1 gene allele (LiSIR2+/-) led to decreased amastigote
virulence, in vitro as well as in vivo. Biochemical approaches revealed that
LiSIR2RP1 has NAD+-dependent deacetylase and ADP-ribosyltransferase activities.
Moreover, we found that LiSIR2RP1 is partially associated with the parasite s
cytoskeleton and is capable of deacetylating tubulin, either in dimers or, when
present, in taxol-stabilized microtubules or in promastigote and amastigote
extracts, which may have significant implications during the remodelling of the
parasite s morphology and its interaction with the host cell. These findings led us to
consider LiSIR2RP1 as a potential therapeutic target. Therefore, aiming at the
identification of LiSIR2RP1 inhibitors, an in silico screening of the National Cancer
Institute compounds 3D database (NCI-2000) containing approximately 2x105
compounds was conducted, seeking the inhibition of the parasite SIR2 over the
human enzyme, SIRT1. Even though this strategy was effective in identifying N-(2-fluorophenyl) nicotinamide, which can be used for lead designing, it failed to
identify a truly potent and selective lead compound.
The presence of a common structural moiety (naphthalene) in some molecules
identified as Sirtuin inhibitors, led us to discover bisnaphthalimidopropyl (BNIP)
derivatives as a new class of inhibitors. Structure-activity studies were conducted
with 12 BNIP derivatives leading to the identification of BNIPDanonane as a potent
and selective inhibitor of the LiSIR2RP1 versus its human counterpart. Indeed,
based on kinetic studies, its inhibitory effect is due to competition with NAD+, which
is supported by docking analysis of BNIP derivatives in the LiSIR2RP1 and hSIRT1
three-dimensional models. Furthermore all the BNIP derivatives are active in vitro
against Leishmania infantum intracellular amastigotes (IC50 lower than 12 M) and
at least one of them, BNIPDaoctane, was identified to be active in vivo since its
administration reduces the parasite load in the spleen and liver of a visceral
leishmaniasis mice model. Therefore, this work will open new perpectives towards
the development of LiSIR2RP1 inhibitors, which interfere with the parasite
development. Doutoramento em Bioquímica PhD Degree - Biochemistry A leishmaniose é uma doença parasitária causada pelo protozoário do género
Leishmania, que afecta milhões de indivíduos, em particular nas regiões tropicais e
subtropicais, sendo deste modo responsável por uma elevada mortalidade e
morbilidade. Na ausência de vacinas para uso humano, o controlo da doença
baseia-se na terapêutica farmacológica. No entanto, os medicamentos disponíveis
não são satisfatórios principalmente devido ao aparecimento de resistências, aos
efeitos laterais indesejáveis, e sobretudo devido à sua eficácia ser limitada em
situações de exacerbação da doença, como a que ocorre em indivíduos com o
sistema imunológico comprometido.
As proteínas pertencentes à família Silent Information Regulator 2 (SIR2),
também designadas de Sirtuins, são proteínas conservadas ao longo da evolução e
classificadas como histonas desacetilases (HDAC) da class III, uma vez que
dependem do NAD+ como co-factor para desacetilar os resíduos de lisina de
diversos substratos. As proteínas incluídas nesta família têm se revelado envolvidas
na regulação de vários processos biológicos como o silenciamento de genes,
reparação do DNA, longevidade, metabolismo, apoptose e desenvolvimento. No
genoma da Leishmania foi identificada a existência de informação genética para
codificar três proteínas homólogas às da família SIR2. Uma das proteínas,
designada de SIR2RP1, encontra-se localizada no citosol e de acordo com uma
abordagem molecular e biológica indirecta parece estar envolvida na sobrevivência
do parasita. A impossibilidade de conseguir remover os dois alelos que codificam
para esta proteína em Leishmania, sem ter havido suplemento epissomal, sugere
um envolvimento determinante da mesma na sobrevivência do parasita. Para além
do que, a remoção de apenas um alelo que codifica a proteína LiSIR2RP1
compromete virulência do parasita tanto in vitro como in vivo. A caracterização
bioquímica revelou que a proteína LiSIR2RP1 apresenta actividade desacetilase e
ADP-ribosiltransferase dependente do NAD+. Adicionalmente, observamos que esta
proteína se encontra parcialmente associada ao citoesqueleto do parasita
catalizando a desacetilação da tubulina na presença de NAD+. Com base nestes
resultados, consideramos a possibilidade de a proteína LiSIR2RP1 representar um
potencial alvo terapêutico. Com o objectivo de identificar novas moléculas que
inibam a proteína SIR2 do parasita e não a proteína humana correspondente,
SIRT1, procedeu-se posteriormente ao rastreio in silico da livraria de compostos do National Cancer Institute 3D database (NCI-2000) contendo aproximadamente
2x105 compostos. Contudo, esta estratégia não permitiu a identificação de um
inibidor potente, permitindo apenas a identificação do N-(2-fluorfenil)nicotinamida,
que poderá ser posteriormente submetido a modificações químicas. Avaliamos
também a capacidade dos compostos derivados do bisnaftalimidopropil (BNIP)
inibirem a proteína LiSIR2RP1. A realização de um estudo de relação estruturaactividade,
que incluiu 12 derivados do BNIP, a proteína LiSIR2RP1, e a proteína
humana correspondente, permitiu identificar os derivados BNIP como uma nova
classe de inibidores das Sirtuins. O composto BNIPDanonano foi seleccionado como
um inibidor potente e selectivo da enzima LiSIR2RP1. Pela realização de cinéticas
enzimáticas e análise computacional de modelos 3D das proteínas, concluímos
tratar-se de um inibidor que actua por competição com o NAD+. Verificamos
também que todos os compostos derivados do BNIP inibem, em ensaios in vitro, o
crescimento da forma amastigota intracelular de L. infantum (IC50 inferiores a
12 M). Pelo menos o derivado BNIPDaoctano foi eficaz a reduzir a carga parasitária
no fígado e baço de ratinhos infectados. Este estudo abre novas perspectivas ao
desenvolvimento de inibidores da proteína LiSIR2RP1, que interfiram com o
crescimento do parasita.
