Author(s):
Comprido, Diogo de Oliveira Ferreira 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10316/25838
Origin: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Subject(s): hnRNP K; BDNF; Transporte de RNA; Tradução nas Dendrites; Plasticidade Sináptica
Description
Neurons are highly polarized cells, and the local synthesis of proteins at the
synapse requires mechanisms to deliver specific transcripts to dendrites. The transport
of newly synthesized mRNAs from the nucleus to dendrites is conducted by RNA
granules that allow the delivery and stabilize transcripts. These granules are
disassembled in response to synaptic stimulation and this is thought to release the
mRNAs for subsequent local protein synthesis. Local protein synthesis at the synapse is
particularly important for the maintenance of LTP (long-term potentiation), a wellknown
form of synaptic plasticity that is thought to underlie learning and memory
processes.
The interaction with different proteins is thought to provide specificity in the
delivery and transport of mRNAs to dendrites. Furthermore, since local translation at
the synapse is induced by synaptic activity, the interaction of RNA binding proteins and
the transcripts is likely to be regulated by intracellular signaling mechanisms. In this
work, we aimed at characterizing the mRNAs associated with the RNA binding protein
hnRNP K in cultured hippocampal neurons, a protein present at the synapse, and the
regulation by the neurotrophin BDNF (brain-derived neurotrophic factor). BDNF plays
an important role in the late phase of LTP, which is dependent on protein synthesis.
Furthermore, we investigated whether hnRNP K is phosphorylated in response to
stimulation of hippocampal neurons with BDNF. hnRNP K was immunoprecipitated
from cultured hippocampal neurons, stimulated or not with BDNF (10 min), and the
transcripts present in the immunoprecipitates were identified by microarray analysis. A
total of 11422 transcripts were identified in hnRNP K immunoprecipitates from cultured
hippocampal neurons under resting conditions. Gene Ontology analysis showed that
ABSTRACT
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these mRNAs code for proteins involved in cellular processes, metabolic processes,
biological regulation and cellular signaling, among others. The interaction of about 50
% of these transcripts was sensitive to stimulation of hippocampal neurons with BDNF,
and in most cases (99.9 %) the neurotrophin decreased the amount of mRNAs coimmunoprecipitated
with hnRNP K. The results obtained for 4 transcripts coding for
synaptic proteins (GluA1, GluA2, GluN1, and CaMKIIβ), as well as for BDNF and its
TrkB receptor, were validated by real-time PCR. The decrease in transcript coimmunoprecipitation
with hnRNP K was correlated with an increase in the
phosphorylation of the protein on Ser302 in hippocampal neurons stimulated with
BDNF
Taken together the results obtained allowed identifying a large group of mRNAs
that are associated (directly or indirectly) with hnRNP K in cultured hippocampal
neurons, and may be transported to dendrites by this RNA binding protein. Also, the
observed BDNF-induced phosphorylation of hnRNP K may change the RNA-protein
interaction since a significant fraction of the mRNAs were dissociated after stimulation
of hippocampal neurons with the neurotrophin. These evidences support the role of
BDNF on the late phase of LTP since we clearly showed that it promotes the release of
the transported mRNAs associated with hnRNP K, which should allow them to be
locally translated. Os neurónios são células altamente polarizadas, e a síntese local de proteínas na
sinapse requer mecanismos para o endereçamento de transcritos específicos para as
dendrites. O transporte de mRNAs recém-sintetizados desde o núcleo até às dendrites é
feito por grânulos de RNA que permitem a entrega e estabilização dos transcritos. Estes
grânulos são desorganizados em resposta à estimulação sináptica, permitindo
possivelmente a libertação dos mRNAs e subsequente síntese proteica local. A síntese
de proteínas na sinapse é particularmente importante para a manutenção da LTP
(potenciação sináptica de longa duração), uma forma bem conhecida de plasticidade
sináptica que se pensa estar na base dos processos de aprendizagem e memória.
A interacção dos diferentes transcritos com proteínas distintas é provavelmente
responsável pela especificidade no endereçamento e no transporte de mRNAs para as
dendrites. Além disso, uma vez que a síntese proteica local na sinapse é induzida pela
actividade sináptica, a interacção entre as proteínas que ligam RNA e os transcritos
deverá sofrer regulação por mecanismos de sinalização intracelular. Neste trabalho,
caracterizámos os mRNAs associados à hnRNP K, uma proteína presente na sinapse e
com capacidade para ligar RNA, em culturas de neurónios de hipocampo. Comparou-se
a população de transcritos que interage com a hnRNP K em condições de repouso e em
células estimuladas com a neurotrofina BDNF (factor neurotrófico derivado do
cérebro). O BDNF desempenha um papel importante na fase tardia do LTP, que é
dependente de síntese proteica. Além disso, investigámos a fosforilação da hnRNP K
em resposta à estimulação dos neurónios de hipocampo com BDNF. A hnRNP K foi
imunoprecipitada a partir de culturas de neurónios de hipocampo, estimuladas ou não
com BDNF (10 min), e os transcritos presentes nos imunoprecipitados foram
RESUMO
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identificados por análise de microarray. Foram identificados 11422 transcritos nos
imunoprecipitados de hnRNP K obtidos a partir de neurónios do hipocampo em cultura
em condições de repouso. A análise através do Gene Ontology revelou que estes
mRNAs codificam proteínas envolvidas em processos celulares, metabolismo,
regulação celular, e sinalização celular, entre outras funções. A interacção de cerca de
metade destes mRNAs foi afectada pela estimulação dos neurónios com BDNF, tendose
observado uma redução na co-imunoprecipitação com a proteína hnRNP K em cerca
de 99.9 % dos casos. Os resultados obtidos para 4 transcritos que codificam proteínas
sinápticas (GluA1, GluA2, GluN1 e CaMKIIβ), bem como para o BDNF e o seu
receptor TrkB, foram validados por PCR em tempo real. A diminuição na coimunoprecipitação
de transcritos com a hnRNP K foi correlacionada com um aumento
na fosforilação da proteína na Ser 302 em neurónios de hipocampo estimulados com
BDNF.
No conjunto, os resultados obtidos permitiram identificar um grande grupo de
mRNAs que estão associados (directa ou indirectamente) com a hnRNP K em culturas
de neurónios de hipocampo. Estudos adicionais são necessários para investigar o papel
da hnRNP K no transporte destes mRNAs para as dendrites. Além disso, a fosforilação
da hnRNP K induzida pelo BDNF poderá afectar a interacção proteína-RNA uma vez
que uma fracção significativa dos transcritos deixou de co-imunoprecipitar com a
hnRNP K após a estimulação dos neurónios de hipocampo com a neurotrofina. Estas
evidências reforçam o papel do BDNF na fase tardia do LTP, uma vez que mostram
claramente que este promove a libertação dos mRNAs transportados associados à
hnRNP K, o que deverá contribuir para a síntese local de proteínas. Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
