Author(s):
Carreira, Bruno Pereira 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10316/18178
Origin: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Subject(s): Células estaminais; Óxido nítrico
Document details
Proliferative mechanisms controlled by nitric oxide in neural stem cells
Description
Neural stem cells proliferate in the adult central nervous system (CNS) in two main regions, the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) of the hippocampus and the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. The finding that neural stem cells are able to divide, migrate and differentiate into several cellular types raised a new hope for restorative neurology. Nitric oxide (NO), a pleiotropic signaling molecule in the CNS has been described to be able to modulate the proliferation of neural stem cells, but whether it acts as a pro- or anti-proliferative agent is still controversial. Some evidence suggests that NO is a physiological inhibitor of cell proliferation. However, under certain conditions, NO can act as a proliferative agent, favoring cell proliferation. Thus, targeting the NO system may be a powerful strategy to control cell proliferation/differentiation. However, the exact mechanisms by which NO regulates neuronal proliferation and differentiation are not yet clarified, and further investigation on this matter is needed. Therefore, the main goal of this work was to study the mechanisms that are involved in the dual effect of NO in neural stem cell proliferation. Cultures of neural stem cells isolated from the SVZ of mice were exposed to a NO donor, in a range of concentrations comprehending both physiological and pathophysiological concentrations. We found that depending on the concentration, NO can have opposite effects on the proliferation of neural stem cells. Relatively low levels of NO, but already considered in the pathopysiological range, increased the proliferation of neural stem cells, while much higher levels of NO reduced proliferation. Very likely, different mechanisms are responsible for this dual effect of NO on neural stem cell proliferation. The proliferative effect of NO in neural stem cells was further investigated, and the underlying mechanisms involved were shown to be dependent on the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK1/2 pathway. We observed that NO rapidly bypasses the epidermal growth factor (EGF) receptor (EGFR) and directly activates p21Ras, as early as 2 min after exposure to NOC-18, triggering cell proliferation via activation of the ERK/MAPK pathway. Moreover, the activation of the ERK/MAPK pathway was shown to be involved in the activation of transcription factors, particularly c-myc, p90RSK and Elk-1. Indeed, activation of p90RSK resulted in a decrease in the nuclear presence of the cyclin-dependent kinase inhibitor 1, p27KIP1, which allows for cell cycle progression. On the other hand, since the main intracellular receptor for NO is guanylyl cyclase, we investigated whether the proliferative effect of NO was mediated by cyclic GMP. We found that short-term exposure of neural stem cell cultures to NO (6 h) increased cell proliferation in a cGMP-independent manner by activating the ERK/MAPK signaling pathway, while long-term exposure to NO (24 h) activated independently the two signaling pathways, MAPK/ERK and the soluble guanylyl cyclase/cyclic GMP/protein kinase G. Concerning the antiproliferative effect of NO, we found that the release of high concentrations of NO by NOC-18 caused the nitration of the EGF receptor, with intermediate formation of peroxynitrite, in SVZ-derived neural stem cells expressing EGFR. Concomitantly with increased nitration in tyrosine residues, NO caused a decrease in the phosphorylation status of the EGFR. Moreover, using a culture model of SVZ-derived stem cells mixed with microglia isolated from wild-type mice (iNOS+/+), similar results were obtained. Thus the increased release of NO by activated iNOS+/+ microglial cells, following treatment with LPS plus IFN-γ, caused nitration of EGFR, an irreversible post-translational modification of tyrosine residues, which parallels the decrease in proliferation of SVZ-derived neural stem cells treated with the inflammatory stimulation. In addition, cells expressing EGF receptor showed a strong labeling for 3-nitrotyrosine, indicative of protein nitration, following treatment with NOC-18. MnTBAP, a scavenger of superoxide, was able to prevent the nitration of the EGFR, as well as increased its phosphorylation status. Furthermore, either MnTBAP, or FeTMPyP, which promotes the degradation of peroxynitrite, were able to rescue the proliferation of neural stem cells in iNOS+/+mixed cultures following inflammation. Finally, using an in vivo model of injury-induced neuroinflammation and neurogenesis, the kainic acid model of temporal lobe epilepsy, we showed that cell proliferation is prevented when the production of NO is abolished by deleting the iNOS gene, in iNOS-/- mice, which strongly suggests that NO promotes neural stem cell proliferation under certain pathophysiological conditions in vivo. Overall, the results presented in this work clarify the mechanisms by which NO regulates the proliferation of neural stem cells. Thus, we show for the first time that supraphysiological levels of NO have a dual effect on neural stem cell proliferation, with different signaling mechanisms. Thus, the p21/ERK/MAPK signaling pathway appears to be involved in the rapid effect of NO in promoting cell cycle progression and early cell proliferation. For a longer exposure to NO, two independent pathways appear to be active: the p21/ERK/MAPK, and also the guanylyl cyclase/cGMP/PKG. Much higher levels of NO administered to SVZ-derived stem cell cultures or in SVZmicroglia mixed cultures, have an antiproliferative effect by decreasing the signaling through the EGFR due to nitration of tyrosine residues in this receptor. Based on our work in the animal model and in cell cultures, our data suggests that NO from inflammatory origin is mostly proliferative. This study suggests that the modulation of the nitrergic system may be useful to harness the potential of endogenous neural stem cells for brain repair. A proliferação de células estaminais neurais é um processo que ocorre no sistema nervoso central (CNS) adulto em duas regiões em particular: na zona subgranular (SGZ) do girus dentado (DG) do hipocampo e na zona subventricular (SVZ) que delimita os ventrículos cerebrais laterais. A descoberta de algumas propriedades das células estaminais neurais, como a capacidade proliferativa e de diferenciação em vários tipos celulares, trouxeram novas perspectivas para a terapia neuro-restaurativa. Portanto, o conhecimento dos mecanismos de regulação destas células constitui um foco de interesse da comunidade científica. O monóxido de azoto, também designado de óxido nítrico (NO), é uma molécula gasosa que intervém na sinalização de ínumeros processos biológicos. Em particular no CNS, o NO tem sido descrito como capaz de modular a proliferação de células estaminais neurais, mas se actua como um agente pró- ou anti-mitótico ainda é controverso, sendo cada vez mais aceite que possa actuar em ambos os sentidos. Alguns autores sugerem que o NO é um inibidor fisiológico da proliferação celular. No entanto, em certas condições, o NO pode actuar como um agente pró-mitótico, favorecendo a proliferação celular. Assim, a modulação do sistema nitrérgico poderá ser uma estratégia poderosa de controlo da proliferação/diferenciação celular. De facto, os mecanismos pelos quais o NO regula a proliferação e diferenciação neuronal ainda não estão esclarecidos, e uma investigação mais aprofundada sobre este assunto é necessária. Neste estudo, o objectivo principal foi estudar os mecanismos de regulação da proliferação das células estaminais neuronais pelo NO. Procurou-se entender qual o efeito do NO na proliferação destas células, se proliferativo ou antiproliferativo, e decifrar os mecanismos responsáveis por esses efeitos. Para a execução do trabalho foram conduzidas experiências in vitro e in vivo. Nas experiências in vitro, culturas de células estaminais neurais isoladas da SVZ de murganhos foram expostas a diferentes concentrações de um fármaco dador de NO, o NOC-18. Foram utilizadas concentrações de NOC-18 que permitiram uma libertação de NO compreendida entre valores fisiológicos e fisiopatológicas, como confirmado pela medição dos níveis de NO nos meios de cultura pela reacção de Griess. Dependendo da concentração, o NO pode ter efeitos opostos na proliferação das células estaminais neurais. Observámos que níveis relativamente baixos de NO, embora na gama fisiopatológica, aumentam a proliferação de células estaminais neurais em cultura, enquanto níveis mais elevados de NO induzem uma redução da proliferação celular. Muito provavelmente, diferentes mecanismos são responsáveis por este duplo efeito do NO na proliferação de células estaminais neurais. Estudámos em seguida os mecanismos envolvidos no efeito proliferativo do NO e observámos que o aumento de proliferação induzido pelo NO é dependente da activação da via de sinalização das proteínacinases activadas por mitogénios (MAPK). O NO entra na célula activando directamente a p21Ras, ultrapassando o receptor do EGF (EGFR). De facto, o NO activa a p21Ras após 2 minutos de incubação, sinalizando pela via das ERK/MAPK, envolvida na activação de factores de transcrição, como o Myc, Elk-1 e p90RSK, que regulam a progressão do ciclo celular. De facto, observámos que a activação da p90RSK resulta numa diminuição dos níveis nucleares da cinase dependente de ciclina 1, p27KIP1, permitindo a progressão do ciclo celular e consequentemente a mitose. Sendo a via de sinalização da guanilato ciclase um dos principais alvos intracelulares do NO, estudámos também o hipotético envolvimento desta via de sinalização na mediação do efeito proliferativo do NO. Curiosamente, a exposição de curta duração (6 horas) ao NO aumenta a proliferação celular de uma forma independente de cGMP, activando a via das p21/ERK/MAPK. Por outro lado, a exposição de longa duração (24 horas) ao NO parece activar ambas as vias de sinalização: a das p21/ERK/MAPK. Globalmente, os resultados apresentados neste trabalho esclarecem os mecanismos pelos quais o NO regula a proliferação de células estaminais neurais. Assim, mostramos que o NO, quando em níveis supra-fisiológicos, poderá ter um efeito duplo na proliferação celular, mediante a activação de diferentes mecanismos de sinalização. Deste modo, a via das p21/ERK/MAPK parece estar envolvida num efeito rápido do NO no sentido de promover a progressão do ciclo celular. Para uma exposição mais longa ao NO, duas vias independentes parecem estar activas: a via das p21/ERK/MAPK, que é a primeira a ser activada, e a via da guanilato ciclasecGMP- PKG. Para níveis muito mais elevados o NO tem um efeito antiproliferativo diminuindo a sinalização do EGFR por intermédio de um mecanismo de modificação proteica pós-translacional, a nitração. De acordo com resultados obtidos no modelo animal e de culturas mistas, o NO de origem inflamatória tem um efeito predominantemente proliferativo. Estes estudo sugere portanto que a modulação do sistema nitrérgico poderá ser útil para aproveitar o potencial das células estaminais neurais endógenas na terapia neuro-regenerativa. Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular) apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Este trabalho foi realizado no Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra, ao abrigo de uma bolsa de doutoramento atribuída pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/23754/2005).
Neural stem cells proliferate in the adult central nervous system (CNS) in two main regions, the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) of the hippocampus and the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. The finding that neural stem cells are able to divide, migrate and differentiate into several cellular types raised a new hope for restorative neurology. Nitric oxide (NO), a pleiotropic signaling molecule in the CNS has been described to be able to modulate the proliferation of neural stem cells, but whether it acts as a pro- or anti-proliferative agent is still controversial. Some evidence suggests that NO is a physiological inhibitor of cell proliferation. However, under certain conditions, NO can act as a proliferative agent, favoring cell proliferation. Thus, targeting the NO system may be a powerful strategy to control cell proliferation/differentiation. However, the exact mechanisms by which NO regulates neuronal proliferation and differentiation are not yet clarified, and further investigation on this matter is needed. Therefore, the main goal of this work was to study the mechanisms that are involved in the dual effect of NO in neural stem cell proliferation. Cultures of neural stem cells isolated from the SVZ of mice were exposed to a NO donor, in a range of concentrations comprehending both physiological and pathophysiological concentrations. We found that depending on the concentration, NO can have opposite effects on the proliferation of neural stem cells. Relatively low levels of NO, but already considered in the pathopysiological range, increased the proliferation of neural stem cells, while much higher levels of NO reduced proliferation. Very likely, different mechanisms are responsible for this dual effect of NO on neural stem cell proliferation. The proliferative effect of NO in neural stem cells was further investigated, and the underlying mechanisms involved were shown to be dependent on the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK1/2 pathway. We observed that NO rapidly bypasses the epidermal growth factor (EGF) receptor (EGFR) and directly activates p21Ras, as early as 2 min after exposure to NOC-18, triggering cell proliferation via activation of the ERK/MAPK pathway. Moreover, the activation of the ERK/MAPK pathway was shown to be involved in the activation of transcription factors, particularly c-myc, p90RSK and Elk-1. Indeed, activation of p90RSK resulted in a decrease in the nuclear presence of the cyclin-dependent kinase inhibitor 1, p27KIP1, which allows for cell cycle progression. On the other hand, since the main intracellular receptor for NO is guanylyl cyclase, we investigated whether the proliferative effect of NO was mediated by cyclic GMP. We found that short-term exposure of neural stem cell cultures to NO (6 h) increased cell proliferation in a cGMP-independent manner by activating the ERK/MAPK signaling pathway, while long-term exposure to NO (24 h) activated independently the two signaling pathways, MAPK/ERK and the soluble guanylyl cyclase/cyclic GMP/protein kinase G. Concerning the antiproliferative effect of NO, we found that the release of high concentrations of NO by NOC-18 caused the nitration of the EGF receptor, with intermediate formation of peroxynitrite, in SVZ-derived neural stem cells expressing EGFR. Concomitantly with increased nitration in tyrosine residues, NO caused a decrease in the phosphorylation status of the EGFR. Moreover, using a culture model of SVZ-derived stem cells mixed with microglia isolated from wild-type mice (iNOS+/+), similar results were obtained. Thus the increased release of NO by activated iNOS+/+ microglial cells, following treatment with LPS plus IFN-γ, caused nitration of EGFR, an irreversible post-translational modification of tyrosine residues, which parallels the decrease in proliferation of SVZ-derived neural stem cells treated with the inflammatory stimulation. In addition, cells expressing EGF receptor showed a strong labeling for 3-nitrotyrosine, indicative of protein nitration, following treatment with NOC-18. MnTBAP, a scavenger of superoxide, was able to prevent the nitration of the EGFR, as well as increased its phosphorylation status. Furthermore, either MnTBAP, or FeTMPyP, which promotes the degradation of peroxynitrite, were able to rescue the proliferation of neural stem cells in iNOS+/+mixed cultures following inflammation. Finally, using an in vivo model of injury-induced neuroinflammation and neurogenesis, the kainic acid model of temporal lobe epilepsy, we showed that cell proliferation is prevented when the production of NO is abolished by deleting the iNOS gene, in iNOS-/- mice, which strongly suggests that NO promotes neural stem cell proliferation under certain pathophysiological conditions in vivo. Overall, the results presented in this work clarify the mechanisms by which NO regulates the proliferation of neural stem cells. Thus, we show for the first time that supraphysiological levels of NO have a dual effect on neural stem cell proliferation, with different signaling mechanisms. Thus, the p21/ERK/MAPK signaling pathway appears to be involved in the rapid effect of NO in promoting cell cycle progression and early cell proliferation. For a longer exposure to NO, two independent pathways appear to be active: the p21/ERK/MAPK, and also the guanylyl cyclase/cGMP/PKG. Much higher levels of NO administered to SVZ-derived stem cell cultures or in SVZmicroglia mixed cultures, have an antiproliferative effect by decreasing the signaling through the EGFR due to nitration of tyrosine residues in this receptor. Based on our work in the animal model and in cell cultures, our data suggests that NO from inflammatory origin is mostly proliferative. This study suggests that the modulation of the nitrergic system may be useful to harness the potential of endogenous neural stem cells for brain repair. A proliferação de células estaminais neurais é um processo que ocorre no sistema nervoso central (CNS) adulto em duas regiões em particular: na zona subgranular (SGZ) do girus dentado (DG) do hipocampo e na zona subventricular (SVZ) que delimita os ventrículos cerebrais laterais. A descoberta de algumas propriedades das células estaminais neurais, como a capacidade proliferativa e de diferenciação em vários tipos celulares, trouxeram novas perspectivas para a terapia neuro-restaurativa. Portanto, o conhecimento dos mecanismos de regulação destas células constitui um foco de interesse da comunidade científica. O monóxido de azoto, também designado de óxido nítrico (NO), é uma molécula gasosa que intervém na sinalização de ínumeros processos biológicos. Em particular no CNS, o NO tem sido descrito como capaz de modular a proliferação de células estaminais neurais, mas se actua como um agente pró- ou anti-mitótico ainda é controverso, sendo cada vez mais aceite que possa actuar em ambos os sentidos. Alguns autores sugerem que o NO é um inibidor fisiológico da proliferação celular. No entanto, em certas condições, o NO pode actuar como um agente pró-mitótico, favorecendo a proliferação celular. Assim, a modulação do sistema nitrérgico poderá ser uma estratégia poderosa de controlo da proliferação/diferenciação celular. De facto, os mecanismos pelos quais o NO regula a proliferação e diferenciação neuronal ainda não estão esclarecidos, e uma investigação mais aprofundada sobre este assunto é necessária. Neste estudo, o objectivo principal foi estudar os mecanismos de regulação da proliferação das células estaminais neuronais pelo NO. Procurou-se entender qual o efeito do NO na proliferação destas células, se proliferativo ou antiproliferativo, e decifrar os mecanismos responsáveis por esses efeitos. Para a execução do trabalho foram conduzidas experiências in vitro e in vivo. Nas experiências in vitro, culturas de células estaminais neurais isoladas da SVZ de murganhos foram expostas a diferentes concentrações de um fármaco dador de NO, o NOC-18. Foram utilizadas concentrações de NOC-18 que permitiram uma libertação de NO compreendida entre valores fisiológicos e fisiopatológicas, como confirmado pela medição dos níveis de NO nos meios de cultura pela reacção de Griess. Dependendo da concentração, o NO pode ter efeitos opostos na proliferação das células estaminais neurais. Observámos que níveis relativamente baixos de NO, embora na gama fisiopatológica, aumentam a proliferação de células estaminais neurais em cultura, enquanto níveis mais elevados de NO induzem uma redução da proliferação celular. Muito provavelmente, diferentes mecanismos são responsáveis por este duplo efeito do NO na proliferação de células estaminais neurais. Estudámos em seguida os mecanismos envolvidos no efeito proliferativo do NO e observámos que o aumento de proliferação induzido pelo NO é dependente da activação da via de sinalização das proteínacinases activadas por mitogénios (MAPK). O NO entra na célula activando directamente a p21Ras, ultrapassando o receptor do EGF (EGFR). De facto, o NO activa a p21Ras após 2 minutos de incubação, sinalizando pela via das ERK/MAPK, envolvida na activação de factores de transcrição, como o Myc, Elk-1 e p90RSK, que regulam a progressão do ciclo celular. De facto, observámos que a activação da p90RSK resulta numa diminuição dos níveis nucleares da cinase dependente de ciclina 1, p27KIP1, permitindo a progressão do ciclo celular e consequentemente a mitose. Sendo a via de sinalização da guanilato ciclase um dos principais alvos intracelulares do NO, estudámos também o hipotético envolvimento desta via de sinalização na mediação do efeito proliferativo do NO. Curiosamente, a exposição de curta duração (6 horas) ao NO aumenta a proliferação celular de uma forma independente de cGMP, activando a via das p21/ERK/MAPK. Por outro lado, a exposição de longa duração (24 horas) ao NO parece activar ambas as vias de sinalização: a das p21/ERK/MAPK. Globalmente, os resultados apresentados neste trabalho esclarecem os mecanismos pelos quais o NO regula a proliferação de células estaminais neurais. Assim, mostramos que o NO, quando em níveis supra-fisiológicos, poderá ter um efeito duplo na proliferação celular, mediante a activação de diferentes mecanismos de sinalização. Deste modo, a via das p21/ERK/MAPK parece estar envolvida num efeito rápido do NO no sentido de promover a progressão do ciclo celular. Para uma exposição mais longa ao NO, duas vias independentes parecem estar activas: a via das p21/ERK/MAPK, que é a primeira a ser activada, e a via da guanilato ciclasecGMP- PKG. Para níveis muito mais elevados o NO tem um efeito antiproliferativo diminuindo a sinalização do EGFR por intermédio de um mecanismo de modificação proteica pós-translacional, a nitração. De acordo com resultados obtidos no modelo animal e de culturas mistas, o NO de origem inflamatória tem um efeito predominantemente proliferativo. Estes estudo sugere portanto que a modulação do sistema nitrérgico poderá ser útil para aproveitar o potencial das células estaminais neurais endógenas na terapia neuro-regenerativa. Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular) apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Este trabalho foi realizado no Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra, ao abrigo de uma bolsa de doutoramento atribuída pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/23754/2005).
Document Type
Doctoral Thesis
Language English
Advisor(s) Carvalho, Caetana
Language English
Advisor(s) Carvalho, Caetana
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