Efeito de vanádio na função fisiológica e na estrutura de actina

• Author(s): Ramos, S.
• Date: 2011
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/4827
• Origin: Sapientia - Universidade do Algarve
• Subject(s): Actina; Decavanadato
• Document Type: Doctoral Thesis
• Language: Portuguese

Description

Tese de dout., Bioquímica, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2011 Nesta dissertação, analisa-se o efeito de diferentes espécies de vanádio na estrutura e função da actina (42 kDa), isolada de músculo esquelético de coelho. Os efeitos putativos das diferentes espécies de vanádio em solução não se encontram devidamente esclarecidos, pelo que é fundamental determinar qual a composição das soluções utilizadas (metavanadato e decavanadato, ambas com V(V)) . Assim, e recorrendo a 51V-RMN, verificou-se que a solução de metavanadato é constituída pelas espécies monomérica (V1), dimérica (V2), tetramérica (V4) e pentamérica (V5) de vanadato, sendo a sua concentração dependente da concentração em oxovanádio(V) total, enquanto que numa solução de decavanadato existem, fundamentalmente, as espécies decamérica, V10 (aprox. 10 % da concentração em oxovanádio(V) total), e V1. A estabilidade de V10 foi analisada por UV-visível, tendo-se concluído que o tempo de meia-vida para a reacção de decomposição é de cerca de 5 horas, sendo a sua energia de activação de 63,4 kJ mol-1. Estabelecidas as condições óptimas que favoreciam a interacção entre o V10 e a actina, da titulação por RMN de uma solução 5 mM decavanadato com G-actina, resultou um V50 = 25,42 ± 2,32 µM G-actina. A partir da titulação de uma solução de actina com VOSO4, por RPE, determinaram-se os valores da constante de dissociação para a G-actina (Kd = 7,48 ± 1,11 µM VOSO4) e F-actina (43,05 ± 5,34 µM VOSO4). O efeito do vanádio na função da actina foi avaliado com recurso ao método de enzimas acoplados, tendo-se verificado que o decavanadato diminui a capacidade de F-actina estimular a actividade fisiológica de subfragmento-1 de miosina em 70% (IC50 = 8,04 ± 1,49 µM decavanadato), enquanto o metavanadato e o VOSO4 produziam uma inibição de apenas 15 %, aproximadamente. Recorrendo à técnica de dispersão de luz, observou-se, ainda, que o decavanadato inibia a polimerização da G-actina (IC50 = 17 ± 0,2 e 370 ± 0,72 µM decavanadato), sendo o efeito do oxovanádio(IV) muito similar, observando-se valores de IC50 = 15,1 ± 0,3 e 335,8 ± 6,3 µM VOSO4). O metavanadato inibe a polimerização da actina apenas para concentrações superiores a 2 mM. O efeito na despolimerização da F-actina foi menos acentuado, com inibições de 20 e 35 % para o metavanadato (IC50 = 2,7 ± 0,3 mM) e o decavanadato (IC50= 1,40 ± 0,09 mM decavanadato), respectivamente, enquanto o VOSO4 conduz a um ligeiro aumento da dispersão de luz. Verificou-se que 1300 µM decavanadato e 500 µM VOSO4 diminuiem a fluorescência intrínseca de Gactina em 30 e 100 %, respectivamente, sendo o efeito na F-actina mais pronunciado na presença de decavanadato (100 %) e menor na presença de VOSO4 (70 %), enquanto que para a solução de metavanadato a diminuição se observa apenas para concentrações superiores a 600 µM, tanto para a Gactina (70 %) como para a F-actina (100 %). No estudo da interacção de oxidovanádio(IV) com a actina, determinaram-se, a partir dos valores das constantes de Stern-Volmer os valores de Kd, tendo-se obtido valores semelhantes ao registados pelos estudos de RPE acima indicados. Além disso, determinou-se o valor do parâmetro A, definido como I320/I365, verificando-se que a actina nativa apresentava um valor de A = 2,6, enquanto que a presença de decavanadato e VOSO4 deslocava o valor de A para 1,4, sugerindo que a actina se encontra inactivada. A superfície hidrofóbica da actina foi determinada com recurso à sonda ANSA, observando-se que a presença de decavanadato contribuía para o seu aumento, na G-actina (2,6 vezes) e na F-actina (1,5 vezes), enquanto que para a solução de metavanadato não se observou qualquer efeito. Por seu turno, a superfície hidrofóbica da G-actina diminui em cerca de 15 % na presença de VOSO4 (IC50 =22,26 ± 2,09 µM VOSO4), não se observando qualquer efeito para a F-actina. O local de ligação de nucleótidos foi avaliado com recurso a ε-ATP, tendo-se verificado que a presença de decavanadato e VOSO4 alteram o valor da constante de velocidade da reacção de troca entre o ATP e a actina (k = 6,5 × 10−3 s−1 e 4,47 x 10-3 s-1 para decavanadato e VOSO4, respectivamente). Além disso, avaliou-se o estado redox dos resíduos cisteína, tendo-se verificado que a presença de decavanadato conduz à oxidação de um dos resíduos localizados no interior hidrofóbico da G-actina (IC50 =7,8 ± 0,2 µM decavanadato), enquanto que na F-actina para além deste (IC50 = 20,9 ± 0,2 µM decavanadato) se observou, também, a oxidação do resíduo Cys-374, exposto ao solvente (IC50 = 11,2 ± 0,1 µM decavanadato). A concomitante redução de vanadato, analisada por RPE, foi apenas observada para a solução de decavanadato. Finalmente, verificou-se, por 1H-RMN, alterações na estrutura da actina após interacção com o decavanadato e o oxidovanádio(IV). A presença de ATP no meio reaccional previne a interacção entre a actina e o vanádio, comprovada em todos os resultados acima apresentados.