Produção de eritropoietina em culturas de células de Arabidopsis thaliana

• Author(s): Dias, Sónia Marisa Castanheira
• Date: 2009
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10362/3377
• Origin: Repositório Institucional da UNL
• Subject(s): Biotecnologia vegetal; Molecular farming; Arabidopsis thaliana; Medicago truncatula; Culturas de células em suspensão; Proteína recombinante
• Document Type: Master Thesis
• Language: Portuguese
• Advisor(s): Abranches, Rita; Pires, Ana

Description

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia O uso de plantas transgénicas para a produção de proteínas recombinantes oferece muitas vantagens comparativamente a sistemas mais convencionais. As culturas de células vegetais em suspensão são particularmente interessantes pois combinam as vantagens da produção em plantas com os benefícios dos sistemas de produção baseados em culturas celulares. Neste trabalho, culturas de células em suspensão de Arabidopsis thaliana foram usadas pela primeira vez para estudar a expressão de proteínas recombinantes, usando a eritropoietina como proteína modelo. Foram geradas culturas de células em suspensão de Arabidopsis a partir de plantas transgénicas expressando EPO na forma secretada (EPO-AH) e na forma retida no retículo endoplasmático (EPO-ERH). A presença de EPO-AH foi confirmada no meio de cultura e de EPO-ERH no extracto celular. A EPO-ERH produzida em Arabidopsis apresentou apenas uma isoforma e uma massa molecular superior comparativamente à EPO na forma secretada produzida em Medicago, também em estudo, o que pode ser um indício de que a EPO secretada está a ser direccionada a vias não esperadas, sofrendo alterações no perfil de glicosilação. Foram utilizadas várias estratégias para purificar EPO das culturas de células de Arabidopsis e de Medicago, incluindo cromatografia de troca iónica e de afinidade. A purificação parcial da EPO foi atingida usando cromatografia de troca catiónica como passo de purificação inicial. Também se observou a morfologia celular e a viabilidade das culturas foi analisada usando microscopia óptica e de fluorescência. As culturas de ambas as espécies foram comparadas, realizando vários procedimentos de coloração com corantes fluorescentes. As culturas de Arabidopsis mostraram células com dimensões menores do que as de Medicago, e agregados celulares mais compactos. Nas células de Medicago o compartimento vacuolar ocupou a maioria do volume celular e a quantidade de citoplasma foi reduzida. As culturas de células em suspensão de Arabidopsis thaliana constituem um sistema promissor para a produção de proteínas recombinantes. Os resultados obtidos neste estudo serão muito úteis para pesquisas futuras que irão contribuir para o estabelecimento de novas plataformas baseadas em plantas para produção de moléculas economicamente importantes.