Author(s):
Paredes, João Cancela de Amorim Falcão 
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/970
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Biologia; Tradução genética; Código genético; Evolução molecular; Genomas
Description
As proteínas existentes nas células são produzidas pelo mecanismo de
tradução do mRNA, no qual a informação genética contida nos genes é
descodificada em cadeias polipeptídicas. O código genético, que define as
regras de descodificação do genoma, minimiza os erros de tradução do
mRNA, garantindo a síntese de proteínas com elevada fidelidade. Esta é
essencial para a estabilidade do proteoma e para a manutenção e
funcionamento dos processos celulares. Em condições fisiológicas normais, os
erros da tradução do mRNA ocorrem com frequências que variam de 10-3 a
10-5 erros por codão descodificado. Situações que aumentam este erro basal
geralmente estão associadas ao envelhecimento, stresse e a doenças; no
entanto, em certos organismos o código genético é traduzido naturalmente
com elevado erro, indicando que a síntese de proteínas aberrantes pode de
algum modo ser vantajosa.
A fim de estudar a resposta celular aos erros de tradução do mRNA,
construímos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um
codão de leucina, usando a expressão constitutiva de um tRNASer mutante.
Este fenómeno genético artificial provocou uma forte diminuição da
esporulação, da viabilidade e da eficiência de mating, afectando imensamente
a reprodução sexual da levedura. Observou-se também uma grande
heterogeneidade no tamanho e na forma das células e elevada instabilidade
genómica, com o aparecimento de populações poliplóides e aneuplóides.
No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fenótipos e
compreender melhor a biologia do erro de tradução do mRNA, construímos
também células de levedura que inserem serina em resposta a um codão de
leucina de modo indutível e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e
de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de
tradução do mRNA. Observou-se a indução de genes envolvidos na resposta
ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um
aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e um forte
impacto negativo na capacidade das células pós-mitóticas re-iniciarem o
crescimento foram também observados. Este fenótipo de perda de viabilidade
celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse
oxidativo é a principal causa de morte celular causada pelos erros de tradução.
Este estudo levanta a hipótese de que o stresse oxidativo e a acumulação de
ROS, ao invés do colapso súbito do proteoma, são as principais causas da
degeneração celular e das doenças humanas associadas aos erros de
tradução do genoma.
ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the
genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome
into the amino acids based information of the proteome. The genetic code
evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and
even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties
of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability
and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal
physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from
10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error
frequency increases are usually associated to aging and disease. However,
there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high
level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial.
In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have
engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive
expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted
serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition
between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation
event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and
affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape
and high instability in the genome were also observed, with the appearance of
some polyploid or aneuploid cell populations.
To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the
biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA
misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA
profiling to determine whether codon misreading affects gene expression.
Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress
response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A
significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative
impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media
were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of
ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by
mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis
that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome
collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular
degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation. Doutoramento em Biologia
