Lichenicidin: regulation, expression and bioengineering in E.coli

• Author(s): Barbosa, Joana Cristina Pacheco
• Date: 2012
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/9548
• Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
• Subject(s): Biologia molecular; Péptidos; Antibióticos; Bioengenharia
• Document Type: Master Thesis
• Language: English
• Advisor(s): Mendo, Sónia; Caetano, Tânia Isabel Sousa

Description

A lichenicidina e um lantibiotico de classe II, naturalmente produzido por B. licheniformis I89. E constituida por dois peptidos denominados Blia e Blib. Este lantibiotico foi o primeiro a ser expresso completamente in vivo num hospedeiro Gram negativo (Escherichia coli). Neste trabalho, pretendeu-se avaliar o impacto da proteina LicR na biossintese da lichenicidina usando um sistema de expressao heterologa em E. coli. A estirpe de E. coli que nao contem o gene licR parece apresentar uma maior producao de lichenicidin do que a estirpe que contem todo o conjunto de genes envolvidos na sintese da lichenicidin. Assim, LicR parece nao apresentar qualquer funcao regulatoria em E. coli ou esta nao podera ser descrita segundo os mecanismos habituais de regulacao da producao de lantibioticos. Paralelamente um sistema de expressao foi construido para produzir cada um dos peptidos da lichenicidina separadamente, tendo sido comparados os niveis de producao de cada um dos peptidos. Este sistema foi usado com sucesso para produzir o peptido BliƒÀ mas nao apresentando qualquer vantagem sobre os sistemas ao nivel da producao. Finalmente, uma biblioteca de mutagenese do peptido Bliƒ¿ foi construida em E. coli e os clones obtidos foram analisados; a maioria dos clones obtidos apresentou bioatividade reduzida ou nula contra Micrococcus luteus. Alguns destes clones foram sequenciados para determinar qual(ais) a(s) mutacao(oes) presente(s) no gene licA1. Lichenicidin is a class II lantibiotic, naturally produced by Bacillus licheniformis I89 strain. It is composed by two peptides: Bliα and Bliβ. This was the first lantibiotic to be fully produced in vivo using a Gram negative host (Escherichia coli). Herein, the impact of LicR protein in lichenicidin biosynthesis was assessed, using an E. coli heterologous expression system. It was shown that the E. coli strain without the licR gene presented increased lichenicidin production, when compared with the strain containing the entire gene cluster. Thus, if LicR presents some regulatory function in E. coli, its role cannot be described according to the usually proposed regulation mechanisms involved in lantibiotic production. Also, an expression system was constructed to produce each lichenicidin peptide independently and this expression system was compared with other available systems in terms of production levels. The system was successfully used to obtain Bliβ peptide. However it did not show any advantage over the systems previously developed. Ultimately, a mutagenesis library of Bliα was constructed in E. coli and the clones were analyzed; the majority of the clones showed low or null bioactivity against Micrococcus luteus. Some of these clones were sequenced to determine which mutation(s) was present in the licA1 gene. Mestrado em Biotecnologia Molecular