Author(s):
Henriques, Ana Gabriel da Silva Cavaleiro 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/949
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Bioquímica; Doença de Alzheimer; Neurobiologia molecular; Proteínas
Description
A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva
patologicamente caracterizada pela presença de placas de amilóide (placas
senis) insolúveis e também pela presença de tranças neurofibrilhares,formadas
pela proteína Tau hiperfosforiladada. O principal constituinte das placas senis
é o peptídeo beta-amilóide (Ab), que deriva do processamento proteolítico da
proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP). Embora Ab exista como
um agregado pouco solúvel nas placas senis, ele é secretado pelas células
como uma molécula solúvel. O Ab “per se” pode afectar o metabolismo da
APP. Alguns autores sugerem que o Ab exerce o seu efeito alterando o
processamento ou catabolismo da APP, outros sugerem que ele também induz
a transcrição da APP, onde aumentando os níveis da APP pode estar a
contribuir para a sua própria produção (mecanismo de “feedback” positivo).
Assim sendo, torna-se difícil consolidar todas estas observações e identificar
as potenciais funções fisiológicas do Ab “in vivo”, ou as consequências da sua
produção. Neste trabalho caracterizaram-se os efeitos do Ab no metabolismo
da APP. Os nossos estudos revelaram que um dos mecanismos induzidos
pelo Ab é a acumulação intracelular do fragmento neuroprotector sAPP
(isAPPa) em estruturas com características vesiculares associadas ao
citosqueleto. Estudos adicionais em culturas primárias revelaram que o Ab
estava a exercer o seu efeito ao nível da secreção vesicular, provavelmente
interferindo com o transporte de APP/sAPP ao longo da rede do citosqueleto.
Esta hipótese é sustentada pelo facto do Ab estar a afectar a estabilidade e a
polimerização de proteínas envolvidas na dinâmica do citosqueleto.
Contrariamente a publicações anteriores o Ab não induziu a transcrição da
APP, na verdade em culturas primárias neuronais foi observado uma
diminuição nos níveis de expressão da APP. Isto foi acompanhado por um
aumento nos fragmentos C-terminais da APP (CTFs) e uma diminuição na
localização nuclear do seu domínio intracelular (AICD), sugerindo alterações
na sinalização nuclear da APP. O Ab pode afectar outras vias de sinalização,
particularmente alterando o balanço entre as actividades das proteínas cinases
e fosfatases, o que pode ter consequências para o desenvolvimento da
doença. Os dados obtidos indicam que o Ab é capaz de inibir a actividade da
proteína fosfatase1, a sua importância numa perspectiva de futuras terapias é
discutida.
Devido à relevância da agregação do Ab para a sua toxicidade, a formação de
complexos com proteínas que promovem a sua desagregação/degradação e o
seu efeito no processamento da APP foi avaliado. Na presença destes
complexos observou-se uma reversão da acumulação isAPP, demonstrando o
potencial terapêutico destas proteínas como moduladores do metabolismo da
APP. Este trabalho permitiu compreender melhor os mecanismos envolvidos
nos efeitos do Ab no processamento da APP e descobrir algumas moléculas
que podem ser relevantes numa perspectiva de diagnóstico e terapia na DA.
ABSTRACT: Alzheimer´s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder
pathologically characterized by the presence of extracellular deposition of
insoluble amyloid plaques (senile plaques) and also by the appearance of
neurofibrillary tangle-bearing neurons, mainly composed of
hyperphosphorylated Tau protein. The major component of senile plaques is
the amyloid-beta (Ab) peptide, derived from proteolytic processing of the
Alzheimer´s amyloid precursor protein (APP). Although Ab exists as an
aggregated, poorly soluble form in brain deposits, it is secreted from cells
during normal metabolism as a soluble molecule. Ab “per se” has been
reported to affect APP metabolism, and while some authors suggest that it may
exert its effects by altering APP processing/catabolism, others reported that it
also induces APP transcription. This latter observation suggested a positive
feedback mechanism resulting in increased APP levels, thus Ab would
stimulate its own production. Difficulties arise when trying to consolidate all
these observations and to identify the potential “in vivo” physiological role of
Ab, or the consequences of its overproduction in AD. Hence, in this work we
characterized the Ab effects on APP metabolism. Our studies reveal that
mechanistically Ab leads to intracellular retention of the neuroprotective
fragment (isAPPa) at vesicular-like densities associated with the cytoskeleton.
Additional studies in primary neuronal cultures revealed that Ab was exerting
an inhibitory effect at the vesicular secretory level, probably by interfering with
APP/sAPP transport along the cytoskeleton network. This hypothesis was
supported by the fact that Ab was affecting the stability and polymerization of
proteins involved in cytoskeleton dynamics. Contrary to previous observations
Ab did not induce APP transcription. In fact for primary neuronal cultures we
observed a decrease on APP expression levels. This was accompanied by an
increase in APP C-terminal fragments (CTFs) and decreased APP intracellular
domain (AICD) nuclear targeting, suggesting altered APP nuclear signaling.
Ab may affect other signaling cascades, for instance by altering the balance
between kinase and phosphatase activities which may have consequences for
the disease progression. Data obtained reveals that Ab was able to inhibit
protein phosphatase1 activity, and the importance of this for therapeutic
approaches is discussed.
Further, it is also known that Ab aggregation state is associated with its
neurotoxicity. Hence, Ab complex formation with proteins that promote its
disaggregation/clearance and its effect on APP processing was evaluated.
These complexes reverse isAPP retention, thus demonstrating the therapeutic
potential of these proteins as modulators of APP metabolism. The work in this
thesis allowed for a better understanding of the molecular mechanisms
underlying Ab effects on APP metabolism and identified molecules relevant for
diagnosis and therapy in AD. Doutoramento em Bioquímica
