Autor(es):
Rebelo, Sandra Maria Tavares da Costa 
Data: 2008
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/946
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Bioquímica; Doença de Alzheimer; Proteínas; Neurobiologia molecular
Descrição
A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença multifactorial e progressiva do sistema
nervoso central. Apresenta uma incidência mundial de 2-7% em indivíduos com
mais de 65 anos e de cerca de 50% em indivíduos acima dos 85 anos de idade. As
principais alterações histopatológicas observadas nos doentes são a presença de
tranças neurofibrilhares intracelulares e depósitos extracelulares de um peptídeo
de 4 KDa denominado Abeta, que é o principal componente das placas de
amilóide. Apesar da sua etiologia multifactorial, há uma correlação bem descrita
entre esta patologia e o Abeta (peptídeo neurotóxico). O Abeta deriva fisiológica e
proteoliticamente de uma glicoproteína transmembranar com características de
receptor: a Proteína Percursora de Amilóide de Alzheimer (PPA). As possíveis
funções fisiológicas da proteína PPA, o seu destino e vias de processamento
celulares, conjuntamente com possíveis proteínas celulares que com ela interajam,
são assim tópicos de interesse e áreas de investigação científica mundial. A PPA
possui na sua estrutura primária sequências consenso para fosforilação, quer no
seu ectodomínio quer no seu domínio intracelular, já descritas como sofrendo
fosforilação “in vitro” e “in vivo”. Mais ainda, em alguns casos esta fosforilação está
associada a estados de doença. Assim sendo, 7 dos 8 aminoácidos que
hipoteticamente podem ser fosforilados no seu domínio intracelular encontram-se
fosforilados em cérebros de doentes de DA, nomeadamente, Tyr653, Ser655, Thr668,
Ser675, Try682, Thr686, Tyr687. O último pertence ao domínio funcional NPTY que é
um sinal típico de endocitose em receptores associados à membrana e um local
consenso para a endocitose. Várias proteínas interagem com este domínio
intracelular da PPA, a maioria possui múltiplos domínios de interacção permitindo a
formação de multi-complexos de sinalização entre a PPA e proteínas celulares.
Existe assim a possibilidade dessas proteínas funcionarem como proteínas
adaptadoras direccionando a PPA para vias de sinalização específicas. A
interacção da PPA com essas proteínas de ligação parece ser regulada por
fosforilação proteica, uma vez que a ligação da PPA à FE65 só ocorre quando a
Thr668 está desfosforilada.
O uso de proteínas de fusão PPA-GFP permitiu avaliar a função do domínio NPTY,
através da mimetização do estado fosforilado (Y687E) e desfosforilado (Y687F) da
Tirosina 687. Resultados contrastantes foram observados na localização subcelular
destas proteínas. A proteína Y687E-PPA-GFP foi detectada na membrana
plasmática mas não foi eficientemente incorporada em vesículas de tranferrina e
apresentou uma diminuição significativa na produção de Abeta. Em contraste, a
proteína Y687F-PPA-GFP é facilmente endocitada, tal como a proteína selvagem,
e produziu mais Abeta, ou seja ocorreu um favorecimento da clivagem pela via da
β-secretase. Os resultados obtidos indicam que este resíduo é importante para o
direccionamento subcelular da proteína PPA e para o seu processamento nas
diferentes vias, nomeadamente secretória e endocítica. A localização subcelular da
PPA pode ser mediada por ligação a proteínas específicas. Um desses exemplos é
a ligação da PPA à RTN3-B, uma vez que ambas co-localizam no retículo
endoplásmico.
Adicionalmente, os resultados apontam no sentido de que as interacções entre a
PPA e as suas proteínas parceiras de ligação estejam dependentes do seu estado
de fosforilação. Com este propósito o papel da Tirosina 687 no estabelecimento
dessas interacções foi avaliado. Os resultados demostram que ambas as proteínas
mutantes ligam FE65 e que esta última é a proteína que medeia a conexão entre a
PPA e a PP1γ. As implicações destas observações na DA e em novas aplicações
terapêuticas para a doença são subsequentemente discutidas.
ABSTRACT: Alzheimer’s disease (AD), the most common age-related dementing illness, is a
progressive multifactorial neurodegenerative disorder of the central nervous
system affecting individuals worldwide with an incidence of 2-7% of post-65
and 50% of post-85 years old. The pathological hallmarks of AD are the
presence of intracellular neurofibrillary tangles and extracellular deposits of a
4kDa amyloid beta peptide (Abeta) forming amyloid plaques in the cerebral
cortex. This disease is multifactorial in its etiology but central to its pathology is
the neurotoxic Abeta peptide. Abeta arises from the proteolytic cleavage of a
larger ubiquitous glycophosphoprotein, APP (Alzheimer Amyloid Precursor
Protein), whose short cytoplasmic domain contains several phosphorylatable
amino acids. The latter can be phosphorylated ‘in vitro’ and ‘in vivo’, and in
some cases phosphorylation appears to be associated with the disease
condition. Furthermore, it was demonstrated that 7 of the 8 potentially
phosphorylatable residues in the intracellular domain of APP were
phosphorylated in AD patients, namely Tyr653, Ser655, Thr668, Ser675, Tyr682,
Thr686 and Tyr687. The latter lies within the NPTY domain, a typical
internalization signal for membrane-associated receptor proteins, as well as a
consensus sequence for coated-pit mediated internalization. Several proteins
interact with the above mentioned cytoplasmic domain of APP, most of them
possessing multiple protein-protein interacting domains, thus forming large
multimolecular APP complexes. It appears therefore that these proteins
function as adaptor proteins directing APP to specific molecular pathways. The
interaction of APP with these binding proteins appears to be regulated by
protein phosphorylation as has been described for FE65 binding, for example.
Using APP-GFP fusion proteins to monitor intracellular pathways, the role of
the NPTY domain was addressed by mimicking Tyr687 constitutive
phosphorylation (Y687E) and dephosphorylation (Y687F), respectively.
Contrasting effects on subcellular APP distribution were observed. Y687EAPP-
GFP was targeted to the membrane but could not be detected in
transferrin containing vesicular structures, and exhibited a concomitant and
dramatic decrease in Abeta production. In contrast, Y687F-APP-GFP was
endocytosed similarly to wild-type APP, but was relatively favoured for betasecretase
cleavage. Overall, Tyr687 appears to be a critical residue determining
APP targeting and processing via different pathways, including secretory,
endocytic and retrograde transport. Significantly, from a disease perspective,
mimicking Tyr687 phosphorylation resulted in a hitherto undescribed inhibition of
Abeta production. Our results provide novel insights into the role of direct APP
phosphorylation on APP targeting, processing and Abeta production. Targeting
of APP is most likely mediated by binding to specific proteins. One such novel
interaction identified was RTN3-B. These two proteins colocalize in the ER.
Additionally, our conclusions so far, favour the model that interaction of APP
with the binding proteins may also be mediated by the phosphorylation state of
APP itself and with this proposal the role of Tyr687on protein-protein interactions
was investigated. We demonstrated that FE65 binds to both Tyr687 mutants and
also that FE65 is the bridging protein between APP and PP1γ.
Our results provide novel insights into the role of direct APP phosphorylation on
processing and Abeta production, pointing towards potential intervention
strategies for the treatment of Alzheimer’s disease. Doutoramento em Bioquímica
