Author(s):
Corticeiro, Sofia Caçoilo 
Date: 2006
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/8957
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Métodos biomoleculares; Leguminosas - Tolerância (fisiologia); Contaminação dos alimentos - Leguminosas; Cádmio - Toxicidade
Description
O crescente aumento de metais pesados no solo, devido a poluiçâo ambiental,
afecta directamente a comunidade microbiana bem como as relações
simbióticas que alguns destes microrganismos estabelecem com leguminosas.
Uma dos metais pesados mais prejudiciais e tóxicos é o cádmio. Devido à sua
elevada toxicidade, este metal constitui uma grave ameaça, não só para as
comunidades bacterianas presentes nos solos, mas também para os outros
organismos, uma vez que a transferência de iões metálicos ao longo da cadeia
alimentar e uma realidade e um problema sério de saúde pública. Sendo a
glutationa um importante agente antioxidante e quelante de metais, este
trabalho foi delineado de modo a perceber qual o papel deste tripéptido na
tolerância ao cádmio em Rhizobium leguminosarum. Inicialmente alguns
isolados de R. leguminosarum foram expostos a diferentes concentrações de
cádmio e foi testada a influência da glutationa no seu crescimento. Dos
isolados que apresentaram um aumento significativo de tolerância na presença
desse tio1 (4 em 5), foram seleccionados dois com graus de tolerância
distintos, E20-8 (tolerante) e NI-2 (sensível), para a realizaçâo do restante
trabalho experimental. Posteriormente foi avaliado o nivel de stresse oxidativo
dos dois isolados, através da determinação dos níveis de GSH e de GSSG
intracelulares e das actividades de algumas das principais enzimas envolvidas
no stresse oxidativo (SOD, CAT, GR e GPX). Os resultados demonstraram que
a exposição ao cádmio induziu stresse oxidativo nas células, o que foi
comprovado pelo aumento na concentração de GSSG e pela indução de
actividade das enzimas estudadas. A adição de glutationa ao meio de
crescimento teve um efeito protector, principalmente no isolado sensível. Os
dados obtidos sugerem que o aumento de tolerância ao cádmio em R.
leguminosarum não está relacionado com uma maior eficiência do mecanismo
antioxidante per si, mas com níveis mais elevados de glutationa intracelular.
Mostrou-se ainda que o fornecimento de glutationa ao isolado sensível
aumentou a sua tolerância. Tendo já sido demonstrado que a capacidade de
aumentar a síntese de glutationa estava relacionada com uma maior tolerância
ao cádmio. Assim é plausível concluir que a glutationa desempenhe um papel
fundamental na tolerância ao cádmio nesta espécie e que esse papel não se
limite á sua actividade como antioxidante. Assim, foi estudado o papel da
glutationa como agente quelante nesta espécie e, através da adaptação de um
protocolo inicialmente desenvolvido para complexos de fitoquelatinas. As
diferentes fracções de cádmio extraídas foram separadas: o cádmio
fracamente ligado a parede foi removido por extracção aquosa em banho de
ultrasons. O cádmio intracelular foi obtido por extracções sequenciais com
tampão HEPES, de modo a manter a estabilidade de possíveis complexos. O
cádmio ligado á membrana e a parede celular foi extraído com ácido. O
cádmio intracelular foi separado por cromatografia de exclusão molecular e as fracções correspondentes aos picos de cadmio foram colhidas e analisadas
por HPLC. Verificou-se que a percentagem de cadmio retido na parede celular
era semelhante nos dois isolados, demonstrando a importância deste
mecanismo, mas confirmando contudo que esta não pode justificar a diferença
de tolerância entre os isolados. O isolado tolerante apresentou uma maior
concentração de cadmio intracelular. A análise por HPLC revelou que a
glutationa era o principal agente quelante de cádmio em Rhizobium, sendo
responsável pela complexação de 75% do cádmio intracelular no isolado
tolerante e por 28% no isolado sensivel. A adição de glutationa ao meio de
crescimento aumentou a eficácia da complexação de cádmio, passando para
90% no isolado tolerante e para 53% no sensível. Os dados apresentados
nesta tese contribuem certamente para a compreensão da tolerância aos
metais pesados em bactérias. No entanto, os resultados deste trabalho não se
cifram só em respostas, mas também em questões. A razão pela qual a adição
de glutationa diminui o cádmio intracelular na estirpe tolerante e qual o destino
dos complexos nas células são alguns dos pontos que terão de ser
esclarecidos em trabalhos futuros. The increase in the anthropogenic activities has introduced new types of
stresses to soil bacteria communities as well as to symbiotic associations
between microbes and legumes. Heavy metal contamination, particularly by
cadmium, constitutes a problem. Because of its high toxicity, even at low
concentrations, cadmium imposes a serious threat to organisms and food-chain
transfer of metal ions has become a major public concern.
Since glutathione is an important antioxidant and rnetal chelator. this study was
undertaken to determine the role of this tripeptide in cadmium tolerance of
Rhizobiurn legurninosarurn. Two strains expressing different degrees of
tolerance to cadmium stress were used and the influente of the addition of
extracelular GSH to the growth media was determined. Oxidative stress and
ROS scavenging enzymes were evaluated, as well as changes in GSH and
GSSG levels. Results confirmed that cadmium imposes oxidative stress in
Rhizobiurn legurninosarurn, which was characterized by an increase in GSSG
formation and an induction of SOD, GPX. GR and CAT activities. Addition of
reduced glutathione to the growth media had a protective effect, particularly in
the sensitive strain.
These findings show that increased tolerance in Rhizobiurn legurninosarum is
not related to a higher efficiency of the oxygen scavengers per se, but with
higher levels of intracellular glutathione. Furthermore, we demonstrated that
glutathione suply to the sensitive strain enhanced tolerance, concluding that
glutathione plays a crucial role in cadmium tolerance in this species.
In a previous report, it was demonstrated that glutathione played an important
role in cadmium detoxification in Rhizobiurn cells. but the molecular role of this
tripeptide remained to be elucidated. In this work, we report an efficient
extraction of GSH-Cd complexes in two R. legurninosarum strains with
different levels of tolerance to cadmium. through a modified protocol, originally
developed for metal-phytochelatins complexes. The different sub-cellular
Cadmium fractions were extracted: loosely bound cadmium was extracted with
water, in an ultrasonic bath; intracellular cadmium was sequentially extracted
with HEPES buffer; and wall-bound cadmium was extracted with acid.
Intracellular cadmium was separated through size exclusion chromatography,
and the amount of cadmium in collected fractions was analysed. Peptide peaks
containing the higher cadmium concentrations were analysed by HPLC.
In both strains, the same percentage of cadmium was retained in cell walls,
hence demonstrating an effective avoidance mechanism, but that was not
responsible for the obse~edto lerance differences, displayed by the two
strains. Intracellular cadmium accumulation was higher in the tolerant strain
and rnetal ions were mainly chelated by small-weight peptides.
HPLC analysis revealed that glutathione was the main cadmium chelator in
Rhizobirim. being responsible for sequestering 75% of intracellular cadmium in
the tolerant strain. The sensitive strain presented a less effective cadmium
complexation; only 28% of intracellular cadmium was sequestered by
glutathione The presence of glutathione increased the efficiency of this
mechanism: the tolerant strain was able to sequester 90% of the intracellular
cadmium and the sensitive strain complexed 53%. Our findings add a novel
and important aspect to the proposed role of glutathione in heavy metal coping
for bacteria. These results can be useful in developing biotechnological
strategies for cadmium bioremediation procedures and open novel
perspectives for the irnprovement of metal tolerance in soil bacteria. However
these findings have raised severa1 questions. The reason why glutathione
supply decreases the intracellular cadmium in the tolerant strain and the fate of
the complexes within the cell are some of the issues that remain to be
elucidated. Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
