Author(s):
Domingues, António Miguel de Jesus 
Date: 2005
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/808
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Microbiologia molecular; Doença de Alzheimer; Neurobiologia molecular
Description
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa resultado da
perda irreversivel de neurónios, principalmente no hipocampo e córtex
cerebral. Esta doença manifesta-se clinicamente pela perda progressiva de
memória, perturbações das funções cognitivas e alterações de
comportamento. Estas alterações são o A DA caracteriza-se
histopatologicamente pela presença de placas senis, devido á acumulação
extracelular do peptideo p-amilóide (Ap), e por tranças neurofibrilhares,
resultantes da hiperfosforilação da proteína tau. A toxicidade induzida pelo
peptídeo Ap está associada a excitotoxicidade, que consiste na libertação
excessiva de glutamato e sobreactivação dos receptores N-metil-D-aspartato
(NMDA), conduzindo ao aumento da concentração intracelular de cálcio e,
consequentemente, a morte neuronal. Os receptores NMDA são compostos
pelas subunidades NRI, NR2A-D e NR3A-B que se associam em vários
subtipos com diferentes características funcionais e farmacológicas, e
distribuem-se de forma heterogénea pelo sistema nervoso central. Neste
trabalho, avaliou-se a influência de diferentes subtipos de receptores NMDA na
toxicidade do peptideo A~I.~,,. Para tal, expressaram-se os subtipos NRIINRZA
ou NRIINRZB em células HEK293. A exposição ao peptideo Ap1.40 diminuiu a
capacidade redutora em células que expressavam NRIINRZA ou NRIINRZB.
Porém, o peptideo Api.40 induziu um aumento da permeabilidade membranar,
traduzida pelo aumento da libertação de lactato desidrogenase (LDH), e uma
diminuição do conteúdo intracelular de ATP somente em células que
expressavam o subtipo NRIINRZA. A presença de MK-801, um antagonista
dos receptores NMDA, preveniu parcialmente a alteração da permeabilidade
membranar e dos niveis energéticos celulares. Não se encontraram evidências
de morte celular por apoptose após exposição ao Ap1.40i uma vez que não se
O ~ S ~ N OaU a ctivação de caspases-2, 3, 8 e 9 ou a fragmentação de ADN. A
estimulação com NMDA e glicina em células que expressavam receptores do
subtipo NRIINRZA resultou num aumento dos niveis intracelulares de cálcio
após a exposição ao peptideo A~I.~,,.N estas condições, não se O ~ S ~ N OaU
activação de calpainas, dependentes de cálcio. Pelo contrário, a exposição a
Ap1.40 diminuiu os niveis intracelulares de cálcio resultantes da estimulação
dos receptores do subtipo NRIINRZB. Os resultados obtidos neste trabalho
sugerem que os receptores NMDA compostos pelas subunidades NRI e NR2A
medeiam preferencialmente a toxicidade induzida pelo peptideo Ap (1-40) por
um processo de morte celular por necrose, devido a alteração da
permeabilidade ao cálcio.
ABSTRACT: Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurological disease that results in
the irreversible loss of neurons, particularly in the hippocampus and cortex. The
clinical hallmarks are progressive impairment in memory, judgment, orientation
to physical surroundings and language. The histopathological hallmarks are
extracellular senile plaques that contain the P-amyloid peptide (AP), and
intracellular neurofibrillary tangles, composed of a hyperphosphorylated form of
the microtubular protein tau. Neurotoxicity induced by AP has been
documented to involve glutamate toxicity, resulting from the activation of Nmethyl-
D-aspartate (NMDA) receptors, elevation of intracellular ca2+ levels and
cell death (excitotoxicity). Glutamatergic NMDA receptors are composed by the
subunits NRI, NRZA-D and NR3A-B that assemble in order to form different
receptor subtypes. These subtypes are distributed heterogeneously throughout
the brain and have different physiological and pharmacological properties. Few
studies have taken into account the structural heterogeneity of the NMDA
receptors. Thus, in the present study, we have examined the contribution of
NRIINRZA and NRllNR2B subtypes in AP toxicity. We have used transiently
transfected HEK293 cells expressing NRIINRZA and NRIINRZB subunits and
analysed the citotoxicity induced by AP1.40. Cells expressing both receptor
subtypes showed a decrease in cell reducing capacity upon exposure to AP1.40.
Analysis of lactate dehydrogenase (LDH) release revealed that AP1~40
enhanced the toxicity induced by expression of NRIINRZA, compared to
NRIINRZB, indicating loss of plasma membrane integrity. Furihermore, in cells
expressing NRIINRZA, exposure to APG~doe creased intracellular ATP content.
MK-801, a NMDA receptor antagonist, partially prevented both the decrease in
cell viability and the energy impairment, These differences could not be
accounted for the activation of caspases-2,3,8 and 9 or the fragmentation of
DNA, excluding the hypothesis of apoptosis. We have also evaluated
intracellular calcium levels upon stimulation with NMDA plus glycine.
Stimulation of the NRIINRZA receptor subtype revealed an increase in
intracellular calcium in cells pre-exposed to AP1.40, as compared to nonexposed
cells. Under these conditions, calcium-dependent calpains were not
activated. Opposite effects were obsewed upon activation of NRllNR2B
receptors, since a decrease in intracellular calcium was obsewed upon
exposure to AP1.40. These data suggest that NRIINRZA-composed NMDA
receptors specifically mediate necrotic cell death in the presence of AP, through
the alteration of intracellular calcium homeostasis. Mestrado em Microbiologia Molecular
