Autor(es):
Pereira, Jacinto José Fonseca 
Data: 2005
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/806
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Biologia molecular; Fungos patogénicos; Doenças infecciosas; Ácido desoxirribonucleico; Bioinformática
Descrição
A tecnologia de microarrays tem uma vasta gama de aplicações em biologia
molecular e medicina. Uma delas é capacidade de diagnosticar infecções
patogénicas em pacientes humanos. Neste projecto, foram implementadas
ferramentas bioinformáticas de selecção de sondas de DNA para desenhar
chips de DNA para o diagnóstico de infecções provocadas por fungos
patogénicos. O objectivo principal deste estudo é identificar, para cada
espécie, um conjunto de sondas de DNA específicas. Cada sonda consiste
num oligonucleótido que hibrida com apenas uma espécie fúngica descoberta
até à data. O sistema foi testado utilizando 10 espécies de fungos patogénicas
que apresentam elevada proximidade. Para isso, foram pesquisadas bases de
dados online e extraídas as sequências de DNA pertencentes aos genes do
RNA ribossomal (SSU, ITS1, ITS2, LSU), que exibem variabilidade entre
espécies. Estas sequências foram de seguida submetidas a alinhamentos
múltiplos e “par a par” sistemáticos, no sentido de se determinar os
oligonucleótidos mais específicos para cada espécie. Este processo foi
executado com recurso aos algoritmos BLAST e Clustal, a algoritmos de
cálculo da temperatura de fusão e a scripts de PERL. Finalmente, as
sequências foram validadas contra uma base de dados universal, para verificar
a especificidade de cada sonda. Para solucionar o problema da baixa
concentração de DNA fúngico em amostras clínicas, foram desenhados pares
de primers para a amplificação por PCR de secções dos 4 genes de rRNA nas
10 espécies de fungos simultaneamente.
ABSTRACT: Microarray technology has a wide variety of applications in molecular biology
and medicine. One of these is the diagnostics of pathogenic infections in
human patients. In this project, bioinformatics tools for DNA probe selection
were set up to design DNA chips for the diagnosis of infections caused by
pathogenic fungi. The main objective of the study was to identify, for each
fungal species, a set of specific DNA probes. Each probe consists of an
oligonucleotide that hybridises with only one, presently discovered, fungal
species. The system was tested using 10 closely related pathogenic fungal
species. For this, online databases were searched and DNA sequence data
belonging to ribosomal RNA genes (SSU, ITS1, ITS2, LSU), which exhibit
variability between species, was downloaded. These sequences were then
subjected to systematic pairwise and multiple alignments in order to find the
most specific oligonucleotides for each species. This procedure was performed
with the BLAST and Clustal algorithms, melting temperature calculation
algorithms and PERL scripting. Finally, the sequences were validated against a
universal database in order to verify the specificity of each probe. To overcome
the problem of the low concentration of fungal DNA in clinic samples, pairs of
primers were designed for the PCR amplification of sections of 4 rRNA genes
in 10 species simultaneously. Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
