Author(s):
Oliveira, Anabela Amorim de 
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/795
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Microbiologia; Fotossensitização; Bactérias; Porfirinas
Description
A formação de endósporos é uma estratégia de sobrevivência
apresentada por algumas bactérias que envolve a formação de um invólucro
com várias camadas muito resistentes a danos provocados pelo calor,
radiações e químicos. As bactérias produtoras de endósporos são
extremamente resistentes a técnicas de desinfecção solar e fotocatalítica.
Os derivados porfirínicos produzem espécies reactivas de oxigénio na
presença de luz e oxigénio molecular, o que pode constituir uma abordagem
interessante na inactivação dos endósporos bacterianos altamente resistentes.
O objectivo deste trabalho foi avaliar o potencial de derivados
porfirínicos na fotoinactivação de endósporos produzidos por espécies do
género Bacillus e também das células vegetativas correspondentes. Bacillus
cereus foi usado como modelo biológico, por ser estruturalmente mais
semelhante a B. anthracis, tendo sido também testadas outras espécies do
género Bacillus (B. subtilis, B. liqueniformis e B. sphaericus), menos críticas
do ponto de vista da biosegurança. Foram utilizados vários derivados
porfirínicos diferindo no número de cargas positivas e nos grupos de mesosubstituição.
O corante Azul de Toluidina (fenotiazina) foi também testado
como fotossensibilizador de referência para endósporos bacterianos.
Suspensões puras de endósporos foram irradiadas, após pré-exposição
no escuro a concentrações de 0.5-60 μM de fotossensibilizador. A cinética de
irradiação foi avaliada a partir da quantificação do teor de UFC em alíquotas
recolhidas no início da experiência e durante a irradiação. Em todas as
experiências foi incluido um controle claro, irradiado sem fotossensibilizador
e um controle escuro, adicionado da concentração máxima de
fotossensibilizador, mas resguardado da luz.
Os resultados obtidos demonstraram que as porfirinas neutras,
monocatiónicas e dicatiónicas são ineficazes na inactivação de endósporos de
B. cereus (< 1 unidade logarítmica de redução).
O derivado porfirínico mais eficaz na inactivação de endósporos foi a molécula tricatiónica com um grupo meso-pentafluorofenilo (Tri-Py+-Me-PF),
tendo sido atingida uma redução de 3.5 unidades logarítmicas (log) na
concentração de 0.5 μM de porfirina, após 4 minutos de irradiação
(40.7 J/cm2). Com as porfirinas tetracatiónica e tricatiónica com um grupo
carboxilo também se observou uma redução da concentração de endósporos
viáveis em mais de 3 log. Estes resultados correspondem à mesma ordem de
grandeza da inactivação obtida com 60 μM de Azul de Toluidina (TBO).
Com endósporos de outras espécies de Bacillus, as porfirinas tri e tetracatiónicas
causaram redução inferior a 1 log na concentração de endósporos
viáveis.
Com condições experimentais semelhantes, os derivados tricatiónicos e
tetracatiónicos causaram a redução de 5 a 7 log na concentração de células
vegetativas de B. cereus e reduções de 2 a 5 log em B. subtilis,
B. liqueniformis e B. sphaericus.
Nenhum dos produtos testados apresentou toxicidade na ausência de
luz.
Os resultados permitem concluir que a modificação estrutural dos
fotossensibilizadores porfirínicos melhora significativamente a sua capacidade
de fotoinactivação, sendo por isso, compostos promissores para aplicação na
desinfecção de tecidos vivos, materiais contaminados e águas residuais.
ABSTRACT: The formation of bacterial endospores is a survival strategy of some
bacteria that implies the formation of an involucrum composed by several
highly resistant layers that increases their resistance to damage caused by
heat, radiation and chemicals. Endospore-producing bacteria are extremely
resistant to solar and photocatalytic disinfection techniques. Porphyrin
derivatives produce reactive oxygen species in the presence of light and
molecular oxygen, and can be regarded as an interesting approach for the
inactivation of highly resistant bacterial endospores.
This work aims to evaluate the potential of porphyrin derivatives for
the photodynamic inactivation (PDI) of endospores and vegetative cells
produced by different species of Bacillus. Bacillus cereus was included as
a model for B. anthracis and the other species tested were B. subtilis, B.
liqueniformis and B. sphaericus. Several porphyrin derivatives, differing in
the number of positive charges and in the meso-substituent groups were
tested. The phenotiazin dye toluidin blue O was also tested as a reference
photosensitizer for bacterial endospores. Pure suspensions of bacterial
endospores were irradiated, after pre-incubation in the dark with
concentrations of 0.5-60 μM of photosensitizer. The kinetics of irradiation
was evaluated by the quantification of CFU in aliquots collected at the
beginning of the experiment and during the irradiation. A light-control
irrradiated without photosentitizer and a dark control with the maximum
concentration of photosensitizer but protected from light, were included in
all the experiments.
Neutral, monocationic and dicationic porphyrins were relatively
ineffective in the inactivation of B. cereus endospores (<1 log unit
reduction). The most effective porphyrin derivative for the inactivation of
endospores was the tricationic porphyrin with a meso-pentafluorophenyl
group. With this photosensitizer, at 0.5 μM, a reduction of 3.5 log units
occurs after only 4 minutes of irradiation (40.7 J/cm2). Reductions of more than 3 log units of the concentration of viable endospores were also
obtained with the tetracationic porphyrin and the tricationic porphyrin with
a carboxyl group. These results correspond to the same order of magnitude
of inactivation obtained with 60 μM of toluidin blue O (TBO).
With endospores of other Bacillus species, the tri and tetra-cationic
porphyrin derivatives caused small reductions (< 1 log) in the
concentration of viable endospores. Under identical conditions, tricationic
and tetracationic derivatives caused reductions of 5 to 7 log in the
concentration of B. cereus vegetative cells and reductions of of 2 to 5 log
units in suspensions of B. subtilis, B. liqueniformis e B. sphaericus cells.
None of the porphyrin derivatives showed toxicity in the absence of light.
The results show that the structural changes in porphyrin derivatives
can improve significantly their potential as photosensitizers for the
inactivation of bacterial endospores and should be considered as interesting
compounds to use in the disinfection of live tissues, contaminated materials
and residual waters. Mestrado em Microbiologia
