Author(s):
Cavaleiro, Eliana Marisa dos Santos 
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/787
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Microbiologia; Aeromonas; Colagénio; Microorganismos patogénicos
Description
Aeromonas hydrophila é uma bactéria Gram-negativa que causa septicemia
quer em peixes quer em humanos. Os principais patologias associados a
infecções por Aeromonas são gastroenterites, infecção de feridas e doença
sistémica. A patogenecidade deste organismo é multifactorial, possuindo
factores na camada superficial proteica (camada S), diversos produtos
extracelulares incluindo proteases, hemolisinas e enterotoxinas incluindo a
acetilcolinesterase que contribui, significativamente, para a larga distribuição e
versátil adaptabilidade a alterações ambientais. As proteases com actividade
gelatinolítica possuem também a capacidade de hidrolisar outras proteínas
importantes, como o colagénio, contribuindo desta forma para a invasão dos
tecidos. Contudo, o papel destes factores na patógenese ainda se encontra
por esclarecer.
Após um estudo in silico, foi identificada no genoma completo de A. hydrophila
ATCC 7966T, uma região codificante AHA_0517. Esta região possui uma
elevada similaridade com sequências codificantes para membros da família
das colagenases. Seguidamente, foi detectada actividade colagenolítica
associada à células usando o péptido sintético 2-furanacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala
(FALGPA).
No presente trabalho foi descrita a clonagem e expressão desta potencial
colagenase em Escherichia coli. Após a amplificação por PCR, usando primers
específicos, o gene AHA_0517 foi clonado num vector de expressão pET-
26b(+). A construção foi transformada num hospedeiro de expressão E. coli
BL21(DE3) sob o controlo de um promotor reconhecido pela RNA polimerase
do fago T7. Análise de restrição e sequenciação de DNA confirmou a
construção. O gene AHA_0517 contém 2748 pares de bases, codifica uma
proteína com 915 aminoácidos com um potencial péptido sinal. Os extractos
celulares de E. coli recombinante exibiram actividade gelatinolítica e
colagenolítica.
Neste trabalho, foi estabelecido o protocolo para avaliação citotóxica, que
permite avaliar o efeito de bactérias transformadas/proteína recombinante no
crescimento e na viabilidade de células Vero.
Os resultados obtidos sugerem que a expressão desta potencial colagenase
pode ter um importante papel na virulência das Aeromonas.
ABSTRACT: Aeromonas hydrophila is a ubiquitous Gram-negative bacterium that can cause
septicaemia in both fish and humans. The main clinical symptoms associated
with Aeromonas infection are gastroenteritis, wound infections, and systemic
illness. The pathogenesis of the organism has been known to involve multiple
factors like a surface array protein layer (S layer), several extracellular products
including proteases, haemolysin, enterotoxins as well as acetycholinesterase
which contribute significantly to their wide distribution and great adaptability to
environmental changes. Proteases contributing to gelatinase activity can also
hydrolyze other biologically important proteins such as collagen, contributing to
cell invasion. Nevertheless the precise role of these factors in pathogenesis is
still unclear.
Following an in silico approach, it was found the AHA_0517 coding region in
the complete genome sequence of A. hydrophila ATCC 7966T was detected
and selected for further studies. This coding region shared high similarity
values with sequences previously identified as codifying members of the
enzyme/collagenase family. From this strain, it was also detected cell
associated collagenase activity by using the synthetic peptide 2-furanacryloyl-
Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA).
In the present work we report the cloning and expression of this putative
collagenase in Escherichia coli. After PCR amplification using specific primers,
the AHA_0517 region was cloned in the expression vector pET-26b(+). The
construction was transformed into the expression host E. coli BL21(DE3) under
the control of T7 RNase promoter. Restriction analysis and DNA sequencing
confirmed the construction. The AHA_0517 gene contained a 2748 bp ORF
encoding a 915 amino acid protein with a putative signal sequence. Cell lysates
from Escherichia coli exhibited detectable gelatinase and collagenase activities.
In this work, the protocol for cytotoxicity examination was established, allowing
the investigation of transformed bacteria/recombinant protein effect on growth
and viability of Vero cells.
Results obtained suggest that collagenase expression may play an important
role in Aeromonas virulence. Mestrado em Microbiologia
Document Type
Master Thesis
Language
Portuguese
Advisor(s)
Duarte, Ana Sofia Direito dos Santos; Henriques, Isabel da Silva
