Autor(es):
Calhau, Vera Mónica Tavares Vinhas 
Data: 2008
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/781
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Microbiologia; Ecossistemas aquáticos; Comunidades microbiológicas; Microorganismos patogénicos; Filogenia
Descrição
As Aeromonas são bactérias autóctones em ambientes aquáticos e constituem
um grave problema em sistemas de aquacultura devido à sua capacidade de
provocar doença em peixes. Estas bactérias são actualmente consideradas
patogéneos emergentes em humanos. Os surtos de doença podem estar
associados à introdução de estirpes virulentas que evoluíram a partir de outros
nichos ou da aquisição de determinantes de virulência do mesmo nicho, ou
ainda como resultado de um desequilíbrio na comunidade local de Aeromonas.
Assim, torna-se essencial desenvolver métodos fiáveis e reprodutíveis para
seguir rotineiramente a dinâmica de comunidades indígenas de Aeromonas de
forma a permitir uma detecção precisa de alterações na sua estrutura,
antecipando potenciais riscos.
Neste estudo, foram desenhados três conjuntos de primers para amplificar
especificamente os genes gyrB, rpoD e sodB de Aeromonas. Métodos de
PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) foram desenvolvidos
com base nestes primers para obter perfis das comunidades. A especificidade
dos primers foi testada utilizando como molde DNA de 27 estirpes de
Aeromonas pertencentes a 17 espécies previamente descritas e também de 13
estirpes de 11 espécies não alvo. Simultaneamente a especificidade dos
primers foi também avaliada in silico através da pesquisa de homologia com
sequências depositadas nas bases de dados. Ambas as metodologias
permitiram confirmar a total especificidade dos três conjuntos de primers e
apenas para os primers RpoD não foi obtida amplificação de duas estirpes de
Aeromonas. Para determinar a consistência da informação filogenética
fornecida pelos fragmentos amplificados, árvores filogenéticas construídas
com base nas sequências dos genes gyrB, rpoD e sodB de Aeromonas
depositadas na base de dados GenBank e com base nas sequências dos
fragmentos amplificados foram comparadas. Verificou-se que os fragmentos
alvos fornecem informação filogenética consistente. Os conjuntos de primers
foram testados em DNA de amostras de água da Ria de Aveiro e os produtos
foram separados por DGGE. Para todas as amostras, e com todos os
conjuntos de primers, obtiveram-se perfis complexos e muito estáveis ao longo
do gradiente de salinidade. Resultados obtidos com as três metodologias
indicam uma maior variabilidade sazonal das comunidades de Aeromonas. A
clonagem e sequenciação dos fragmentos obtidos a partir das amostras
ambientais confirmam a especificidade dos primers e revelam que os filotipos
dominantes nestas comunidades apresentam elevada similaridade com
estirpes de várias espécies de Aeromonas comuns em ambientes aquáticos
como sejam A. alossacarophila, A. veronii e A. sobria.
Segundo o nosso conhecimento, este estudo apresenta a primeira tentativa de
optimização e validação de métodos independentes do cultivo específicos para
Aeromonas. Os sistemas desenvolvidos apresentam várias vantagens e
consequentemente constituem valiosas ferramentas para avaliar a diversidade
e seguir a dinâmica de comunidades de Aeromonas. A utilização de mais de
um conjunto de primers pode ser útil para obter uma representação mais clara
e real da comunidade em estudo. Os métodos desenvolvidos poderão ainda
ser adaptados de forma a serem aplicados em outro tipo de amostras
ambientais o que poderá ser importante devido à ampla distribuição das
Aeromonas e às suas capacidades patogénicas.
ABSTRACT: Aeromonas are bacteria autochtonous in aquatic environments, and they
constitute a serious problem in aquaculture systems because of their capability
to cause disease in fishes. Aeromonads are also nowadays considered as
emerging pathogens in humans. Disease outbreaks may be associated with the
introduction of virulent Aeromonas strains that evolved in other niches,
acquisition of virulence determinants in the same niche, or as a result of
disequilibrium in the local Aeromonas community. Thus, it becomes essential
the development of reliable and reproducible methods to routinely follow the
dynamics of indigenous Aeromonas communities and to allow an accurate
detection of alterations in their structure, anticipating potential risks.
In this study 3 primer sets were designed to specifically amplify fragments of
the genes gyrB, rpoD and sodB from Aeromonas. A PCR-DGGE (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis) method based on such primers was established
to obtain community specific profiles. Primers specificity was tested by using as
template DNA from 27 Aeromonas strains belonging to 17 previously described
species, and also from 13 strains from 11 non-target species. Specificity was
also assessed in silico using the BLAST tool, by checking sequence matches
against the GenBank database. Results obtained confirmed the specificity of all
primer sets and only primer set RpoD failed to amplify from two Aeromonas
strains. To determine the phylogenetic information contained in the amplified
fragments, gyrB, rpoD and sodB sequences available in the GenBank database
from Aeromonas species were downloaded and submitted to phylogenetic
analyses. A phylogenetic analysis following the same procedures was
performed using the PCR target fragments and trees were compared. The
phylogenetic information contained in the target fragments was confirmed to be
consistent. Primer sets were tested in total DNA from estuarine water samples.
A DGGE assay was optimized to separate the PCR products. Community
specific profiles were obtained from each sample, for each primer pair. Profiles
were very complex and rather stable along the salinity gradient. Aeromonas
communities varied essentially in a seasonal basis. Cloning and sequencing of
the fragments obtained from environmental DNA confirmed the specificity of the
primers and revealed that the dominant phylotypes affiliated with strains
included in species common in aquatic environments such as A.
alossacarophila, A. veronii e A. sobria.
To our knowledge, this study presents the first attempt to optimize and validate
Aeromonas-specific culture-independent methodologies. Results indicate that
all the developed systems present several advantages and therefore constitute
valuable tools to assess diversity and follow the dynamics of Aeromonas
communities. The utilization of more than one set of primers may be useful for
providing a more reliable and clear representation of the community. The
developed methods may be adapted to apply in other types of samples, which
may be important due to the wide distribution of aeromonads in the
environment and to their pathogenic properties. Mestrado em Microbiologia
