Author(s):
Rocha, Joana Fernandes da 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/7389
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Biomedicina; Doença de Alzheimer; Proteínas; Fosforilação
Description
Amyloid Precursor Protein (APP) is a type 1 membrane protein that suffers
proteolytic cleavages and has been implicated in roles such as cell adherence,
survival, migration and differentiation. Although a role in neuritogenesis has
been attributed to APP, some contradictory results have been reported
regarding the benefits of knocking-down or overexpressing APP. Further, while
the addition of the APP proteolytic sAPP (secreted APP) fragment to the cell
medium enhances neuritogenesis, the amount of cellular APP and other APP
fragments may be deleterious for this process. Further, preliminary work from
the Neuroscience laboratory of the Center for Cell Biology indicated that pAPP
(APP phosphorylated at the S655 residue) can potentially be crucial in APPmediated
neuronal differentiation, for example by increasing APP cleavage to
its biological fragment sAPP or APP binding to specific signal transducers.
In this work, the capacity of APP and pAPP to mediate neuronal differentiation
was tested, in the initial period of retinoic acid (RA)-induced SH-SY5Y cells
differentiation. These neuroblastoma cells are a well documented neuronal-like
cell model used in neuronal differentiation studies. Several molecular tools
were used, including wild-type and phosphomutants APP-GFP. The evaluation
of differentiation included neuritogenic output analysis by bright field and
epifluorescence microscopy, using various approaches. Namely scoring the
number of differentiated cells and performing morphometric analyses of
transfected cells and of the all cellular population. The levels of APP and
medium secreted sAPP, and of cytoskeleton-related proteins and posttranslational
modifications, such as MAP2, Acetylated Tubulin and Actin were
also quantified by Western blot analysis, and related to the morphological
parameters. Additionally, the potential role of AICD in APP-mediated neuronal
differentiation was inferred from pharmacologic assays, where its generation is
inhibited.
Together the results obtained show that APP, sAPP and AICD modulate
neuritogenesis in a complex and well-ordered manner. While long-term
increases in APP can be detrimental to neuronal-like differentiation, in an
AICD-dependent manner, short-term increases benefit this process in an APP
S655 phosphorylation dependent manner, potentially involving sAPP secretion
and specific cytoskeleton rearrangements. A Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer (PPA) é uma proteína
membranar tipo 1 sujeita a processamento proteolítico que tem sido associada
a funções como adesão celular, sobrevivência, migração e diferenciação.
Apesar de lhe terem sido atribuídas funções na neuritogénese, os dados
experimentais obtidos até à data que envolveram modulação dos níveis da
PPA revelam-se contraditórios. De facto, enquanto a adição do fragmento PPA
secretado (PPAs) ao meio celular favorece a neuritogénese, a quantidade de
PPA celular e de outros fragmentos da PPA poderão já não constituir um
benefício para este processo. Adicionalmente, dados preliminares do
laboratório de Neurociências do Centro de Biologia Celular sugerem que a
PPAp (PPA fosforilada na S655) poderá ser fundamental na diferenciação
neuronal mediada pela PPA, nomeadamente por aumentar a proteólise da
PPA a PPAs ou a ligação da PPA a sinais de transdução específicos.
No presente trabalho, avaliou-se a capacidade da PPA e PPAp em mediar o
período inicial de diferenciação neuronal induzida por ácido retinóico. Para tal
recorreu-se a células de neuroblastoma SH-SY5Y, um modelo celular do tipo
neuronal bem estabelecido para estudos de diferenciação. Adicionalmente,
várias ferramentas moleculares, como PPA-GFP selvagem e fosfomutantes
foram usadas. A avaliação da diferenciação incluiu a análise de vários
parâmetros neuritogénicos por microscopia de luz (de campo claro e de
fluorescência), nomeadamente monitorização de células diferenciadas e
análises morfométricas das células transfectadas e da população geral. Os
níveis de PPA e PPAs, e de proteínas relacionadas com citosqueleto e suas
modificações pós-traducionais (MAP2, Tubulina Acetilada e Actina) também
foram quantificados. Além do mais, a influência do DIP na diferenciação
neuronal dependente de PPA foi avaliada usando um composto farmacológico
para inibir a sua produção.
De um modo geral, os resultados obtidos demonstram que a PPA, PPAs e DIP
modulam a neuritogénese de um modo complexo e ordenado. Enquanto a
indução de níveis altos de expressão de PPA (48h) podem ser detrimentais
para a diferenciação tipo-neuronal, de uma forma dependente de DIP,
induções mais breves (24h) beneficiam este processo de um modo
dependente da fosforilação na S655, potencialmente envolvendo a secreção
de PPA e rearranjos específicos do citosqueleto. Mestrado em Biomedicina Molecular
