Author(s):
Guedes, Sofia de Morais Correia Pereira 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/7034
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Bioquímica; Proteínas - Oxidação; Glicosilação; Stresse oxidativo; Proteómica
Description
A glicosilação não-enzimática e o stress oxidativo representam dois processos
importantes visto desempenharem um papel importante no que respeita às
complicações de vários processos patofisiológicos. No presente, a associação
entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação de proteínas é reconhecida
como sendo um dos principais responsáveis pela acumulação de proteínas
não-funcionais que, por sua vez, promove uma contínua sensibilização para
um aumento do stress oxidativo ao nível celular. Embora esteja disponível
bastante informação no que respeita aos dois processos e suas
consequências ao nível estrutural e funcional, permanecem questões por
esclarecer acerca do que se desenvolve ao nível molecular. Com o objectivo
de contribuir para uma melhor compreensão da relação entre a glicosilação
não-enzimática e a oxidação, proteínas modelo (albumina, insulina e histonas
H2B e H1) foram submetidas a sistemas in vitro de glicosilação não-enzimática
e oxidação em condições controladas e durante um período de tempo
específico. A identificação dos locais de glicosilação e oxidação foi realizada
através de uma abordagem proteómica, na qual após digestão enzimática se
procedeu à análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de
massa tandem (MALDI-TOF/TOF).
Esta abordagem permitiu a obtenção de elevadas taxas de cobertura das
sequências proteicas, permitindo a identificação dos locais preferenciais de
glicosilação e oxidação nas diferentes proteínas estudadas. Como esperado,
os resíduos de lisina foram os preferencialmente glicosilados. No que respeita
à oxidação, além das modificações envolvendo hidroxilações e adições de
oxigénio, foram identificadas deamidações, carbamilações e conversões
oxidativas específicas de vários aminoácidos. No geral, os resíduos mais
afectados pela oxidação foram os resíduos de cisteína, metionina, triptofano,
tirosina, prolina, lisina e fenilalanina. Ao longo do período de tempo estudado,
os resultados indicaram que a oxidação teve início em zonas expostas da
proteína e/ou localizadas na vizinhança de resíduos de cisteína e metionina,
ao invés de exibir um comportamente aleatório, ocorrendo de uma forma nãolinear
por sua vez dependente da estabilidade conformacional da proteína. O
estudo ao longo do tempo mostrou igualmente que, no caso das proteínas préglicosiladas,
a oxidação das mesmas ocorreu de forma mais rápida e
acentuada, sugerindo que as alterações estruturais induzidas pela glicosilação
promovem um estado pro-oxidativo. No caso das proteínas pré-glicosiladas e
oxidadas, foi identificado um maior número de modificações oxidativas assim
como de resíduos modificados na vizinhança de resíduos glicosilados. Com
esta abordagem é realizada uma importante contribuição na investigação das
consequências do dano ‘glico-oxidativo’ em proteínas ao nível molecular
através da combinação da espectrometria de massa e da bioinformática. Glycation and oxidative stress are two important processes known to play a key
role in complications of many pathophysiological processes. It is nowadays
acknowledged the association between glycation and oxidation events as a
major responsible for the accumulation of non-functional damaged proteins that
in turn promote continuous sensitization to further oxidative stress at the
cellular level. Despite the large amount of information concerning both events
and their consequences at structural and functional levels, questions remain to
answer on what happens at the protein molecular level. With the aim of
contributing to better understand the interrelationship between glycation and
oxidation, model proteins (BSA, insulin and histones H2B and H1) were
submitted to in vitro systems of glycation and oxidation under controlled
conditions and through a specific period of time. Identification of glycation and
oxidation sites was performed through a proteomics approach. Protein samples
were enzimatically digested and further analyzed by nano-liquid
chromatography coupled to MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.
This approach allowed obtaining high protein coverage rates, enabling the
identification of the most susceptible sites of glycation and oxidation in the
different studied proteins. As expected, lysine residues were preferentially
glycated and with respect to oxidation, besides protein hydroxyl derivatives and
oxygen additions, modifications such as deamidations, carbamylations and
specific amino acid oxidative conversions were detected. In general, the main
affected amino acids by oxidative damage were cysteine, methionine,
tryptophan, tyrosine, proline, lysine and phenylalanine. The time-course study
of the oxidative damage indicated the oxidative attack, rather than occurring
randomly, initiates at surface-exposed regions and/or near cysteine and
methionine residues and occurs in a non-linear way depending on the
conformational stability of the protein. Time-course analysis also showed a
more pronounced and earlier occurrence of the oxidative damage in the case of
preglycated proteins, suggesting that structural changes caused by glycation
induce a pro-oxidant state. This increased oxidative damage included not only
a greater number of oxidative modifications, but also of oxidized residues,
occurring in the vicinity of the glycated residues. Through this kind of approach,
an important contribution is made in the investigation of the consequences of
protein ‘glycoxidative’ damage at a molecular level through the profit
combination of mass spectrometry and bioinformatics. Doutoramento em Bioquímica
