Author(s):
Alves, Artur Jorge da Costa Peixoto 
Date: 2001
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/4358
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Microbiologia molecular - Teses de mestrado; Genética vegetal; Videiras; Doenças das plantas; Fungos patogénicos
Description
O síndroma da esca é uma das doenças mais destrutivas da videira (Vitis
vinifera L.), estando disseminado pela grande maioria dos países onde
tradicionalmente se cultiva a vinha, tendo sido já identificada em diversas
regiões vitivinícolas de Portugal. Pensa-se que esta doença resulta da acção
de diversos fungos actuando conjuntamente ou em sucessão. De entre estes,
os mais frequentes são fungos mitospóricos do género Phaeoacremonium.
Neste trabalho foram analisadas 14 estirpes deste género isoladas de videiras
afectadas com esca e pertencentes às espécies P. chlamydosporum, P.
aleophilum, P. angustius e P. viticola.
Foram realizados estudos sobre alguns aspectos fisiológicos destas estirpes,
nomeadamente a produção de enzimas extracelulares e sensibilidade a
fungicidas. Todas as estirpes revelaram produzir actividade de protease,
lipase, amilase, celulase, xilanase e pectinase. Adicionalmente as estirpes de
P. aleophilum, P. angustius e P. viticola produzem lacase e pectato liase.
Todas as estirpes revelaram também maior sensibilidade aos fungicidas
tiabendazol e carbendazima, do que ao zirame e ao arsenito de sódio.
Neste estudo foram ainda aplicados métodos moleculares no intuito de
estabelecer metodologias que permitam uma identificação/classificação rápida
e fidedigna de novos isolados, bem como a tipificação e avaliação do grau de
diversidade genómica destes. Foram também aplicados métodos moleculares
na tentativa de contribuir de algum modo para o esclarecimento da posição
taxonómica deste género.
Uma abordagem à separação do cariótipo destes organismos por electroforese
em campo pulsado (PFGE) demonstrou que o cariótipo dos organismos
classificados como P. chlamydosporum, é substancialmente diferente do
cariótipo dos organismos pertencentes às restantes espécies. Métodos
moleculares direccionados para regiões conservadas no genoma parecem ser
os mais adequados para uma identificação ao nível da espécie. Assim, a
análise de ribotipagem, utilizando a ER BamHI, e a amplificação da região
ITS2 por PCR, seguida de digestão com a ER NciI (ITS-ARDRA) revelaram
capacidade para aplicação na identificação de novos isolados. Os métodos de
rep-PCR e MSP-PCR permitem a tipagem e avaliação do grau de diversidade
genómica de isolados/estirpes.
Os resultados da caracterização genotípica permitem verificar que a espécie P.
chlamydosporum é muito diferente das espécies P. aleophilum, P. angustius e
P. viticola, o que está de acordo com a sua reclassificação no novo género
Phaeomoniella. De igual modo, e tal como descrito, os resultados obtidos
indicam também que as espécies P. aleophilum e P. angustius são idênticas.
Foi ainda clonado e sequenciado um fragmento de sintetase de quitina de
cada uma das estirpes de P. chlamydosporum. Nas restantes espécies não foi
possível detectar fragmentos homólogos a este.
A análise da sequência nucleotídica e de a.a. deduzida revelou tratar-se de
uma sintetase de quitina de classe I. A análise filogenética desta sequência
mostra que P. chlamydosporum forma um grupo à parte das restantes
espécies analisadas. De todas estas, P. chlamydosporum está aparentemente
mais próxima de espécies de ascomicetos, tais como A. niger, A. nidulans, B.
dermatitidis e H. capsulatum. Esca syndrome is one of the most destructive diseases of grapevine (Vitis
vinifera L.). This disease is widespread in the vast majority of countries where
vines are grown, and was already identified in several Portuguese regions.
Apparently it results from the action of several fungi acting in combination or
forming a succession of microorganisms. Among these, the most frequent are
mitosporic fungi of the genus Phaeoacremonium.
In this work, 14 strains of this genus isolated from esca affected grapevines
and belonging to the species P. chlamydosporum, P. aleophilum, P. angustius
and P. viticola were studied.
Studies on some physiological aspects were directed to the production of
extracellular enzymes and sensitivity to fungicides. All strains exhibited lipase,
amylase, cellulase, xylanase and pectinase activities. Additionally strains from
P. aleophilum, P. angustius and P. viticola produced laccase and pectate lyase.
All strains also revealed greater sensitivity to fungicides thiabendazol and
carbendazim than to ziram or sodium arsenite.
Molecular methods were used in this work aiming to establish methodologies
that allow an easier and more reliable identification/classification of new
isolates, and also the typing and evaluation of genetic diversity of these
isolates. We also used molecular methods that may help shedding some light
into the taxonomy of these fungi.
An approach to the separation of the karyotype of these organisms using
pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was made. It was possible to show that
the electrophoretic karyotyope of P. chlamydosporum is considerably different
from the electrophoretic karyotyope of the remaining species of the genus.
Molecular methods directed to conserved regions in the genome seem to be
the most adequate to identification at species level. So, ribotyping using BamHI
and the PCR amplification of ITS2 region followed by NciI digestion of amplified
products (ITS -ARDRA) appear as good methods to be applied in the
identification of new isolates. rep-PCR and MSP-PCR allow the typing and
evaluation of genetic diversity of isolates/strains.
The results from the genetic characterisation allowed us to verify that P.
chlamydosporum is very different from P. aleophilum, P. angustius and P.
viticola. This is in agreement with it’s reclassification in the new genus
Phaeomoniella. In the same way and as described, the results obtained show
that the species P. aleophilum and P. angustius are identical.
A chitin synthase DNA fragment was cloned and sequenced for all P.
chlamydosporum strains. In all other species it was not possible to detect
homologues of this fragment.
The nucleotide and deduced amino acid sequence analysis revealed that this
fragment belonged to a class I chitin synthase. The phylogenetic analysis
based on this sequence revealed that P. chlamydosporum forms a group
distinct from the other species analysed. Nevertheless, among these P.
chlamydosporum seems more closely related to ascomycetes like A. niger, A.
nidulans, B. dermatitidis and H. capsulatum. Mestrado em Microbiologia Molecular
