Autor(es):
Pascoal, Sónia Cristina Marques 
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/4267
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Biologia; Gastrópodes; Fenotipos; Genética ecológica; Ecossistemas aquáticos; Expressão genética; Alterações ambientais; Nucella lapillus
Descrição
O conhecimento de mecanismos de genómica funcional tem sido
maioritariamente adquirido pela utilização de organismos modelo que são
mantidos em condições laboratoriais. Contudo, estes organismos não
reflectem as respostas a alterações ambientais. Por outro lado, várias
espécies, ecologicamente bem estudadas, reflectem bem as interacções entre
genes e ambiente mas que, das quais não existem recursos genéticos
disponíveis. O imposex, caracterizado pela superimposição de caracteres
sexuais masculinos em fêmeas, é induzido pelo tributilestanho (TBT) e
trifenilestanho (TPT) e representa um dos melhores exemplos de disrupção
endócrina com causas antropogénicas no ambiente aquático. Com o intuito de
elucidar as bases moleculares deste fenómeno, procedeu-se à combinação
das metodologias de pirosequenciação (sequenciação 454 da Roche) e
microarrays (Agilent 4*180K) de forma a contribuir para um melhor
conhecimento desta interacção gene-ambiente no gastrópode Nucella lapillus,
uma espécie sentinela para imposex. O trancriptoma de N. lapillus foi
sequenciado, reconstruído e anotado e posteriormente utilizado para a
produção de um “array” de nucleótidos. Este array foi então utilizado para
explorar níveis de expressão génica em resposta à contaminação por TBT. Os
resultados obtidos confirmaram as hipóteses anteriormente propostas
(esteróidica, neuroendócrina, retinóica) e adicionalmente revelou a existência
de potenciais novos mecanismos envolvidos no fenómeno imposex. Evidência
para alvos moleculares de disrupção endócrina não relacionados com funções
reprodutoras, tais como, sistema imunitário, apoptose e supressores de
tumores, foram identificados. Apesar disso, tendo em conta a forte
componente reprodutiva do imposex, esta componente funcional foi a mais
explorada. Assim, factores de transcrição e receptores nucleares lipofílicos,
funções mitocondriais e actividade de transporte celular envolvidos na
diferenciação de géneros estão na base de potenciais novos mecanismos
associados ao imposex em N. lapillus. Em particular, foi identificado como
estando sobre-expresso, um possível homólogo do receptor nuclear
“peroxisome proliferator-activated receptor gamma” (PPARγ), cuja função na
indução de imposex foi confirmada experimentalmente in vivo após injecção
dos animais com Rosiglitazone, um conhecido ligando de PPARγ em
vertebrados. De uma forma geral, os resultados obtidos mostram que o
fenómeno imposex é um mecanismo complexo, que possivelmente envolve a
cascata de sinalização envolvendo o receptor retinoid X (RXR):PPARγ
“heterodimer” que, até à data não foi descrito em invertebrados.
Adicionalmente, os resultados obtidos apontam para alguma conservação de
mecanismos de acção envolvidos na disrupção endócrina em invertebrados e
vertebrados.
Finalmente, a informação molecular produzida e as ferramentas moleculares
desenvolvidas contribuem de forma significativa para um melhor conhecimento
do fenómeno imposex e constituem importantes recursos para a continuação
da investigação deste fenómeno e, adicionalmente, poderão vir a ser aplicadas
no estudo de outras respostas a alterações ambientais usando N. lapillus como
organismo modelo.
Neste sentido, N. lapillus foi também utilizada para explorar a adaptação na
morfologia da concha em resposta a alterações naturais induzidas por acção
das ondas e pelo risco de predação por caranguejos. O contributo da
componente genética, plástica e da sua interacção para a expressão fenotípica
é crucial para compreender a evolução de caracteres adaptativos a ambientes
heterogéneos. A contribuição destes factores na morfologia da concha de N.
lapillus foi explorada recorrendo a transplantes recíprocos e experiências
laboratoriais em ambiente comum (com e sem influência de predação) e
complementada com análises genéticas, utilizando juvenis provenientes de
locais representativos de costas expostas e abrigadas da acção das ondas. As
populações estudadas são diferentes geneticamente mas possuem o mesmo
cariótipo. Adicionalmente, análises morfométricas revelaram plasticidade da
morfologia da concha em ambas as direcções dos transplantes recíprocos e
também a retenção parcial, em ambiente comum, da forma da concha nos
indivíduos da F2, indicando uma correlação positiva (co-gradiente) entre
heritabilidade e plasticidade. A presença de estímulos de predação por
caranguejos estimulou a produção de conchas com labros mais grossos, de
forma mais evidente em animais recolhidos de costas expostas e também
provocou alterações na forma da concha em animais desta proveniência.
Estes dados sugerem contra-gradiente em alterações provocadas por
predação na morfologia da concha, na produção de labros mais grossos e em
níveis de crescimento.
O estudo das interacções gene-ambiente descritas acima demonstram a actual
possibilidade de produzir recursos e conhecimento genómico numa espécie
bem caracterizada ecologicamente mas com limitada informação genómica.
Estes recursos permitem um maior conhecimento biológico desta espécie e
abrirão novas oportunidades de investigação, que até aqui seriam impossíveis
de abordar. Our understanding of functional genomic mechanisms is largely acquired from
model organisms through laboratory conditions of exposure. Yet, these
laboratory models typically have little environmental relevance. Conversely,
there are numerous “ecological” model species that present important geneenvironment
interactions, but lack genomic resources. Imposex, the
superimposition of male sexual characteristics in females, is caused by
tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) and provides among the most widely
cited ecological examples of anthropogenically-induced endocrine disruption in
aquatic ecosystems. To further elucidate the functional genomic basis of
imposex, combinations of 454 Roche pyrosequencing and microarray
technologies (Agilent 4*180K) were employed to elucidate the nature and
extent of gene-environment interactions in the prosobranch gastropod, Nucella
lapillus, a recognized sentinel for TBT-induced imposex. Following
transcriptome characterization (de novo sequencing, assembly and
annotation), microarray fabrication and competitive hybridizations, differential
gene expression analyses provided support for previously suggested
hypotheses underpinning imposex (steroid, neuroendocrine, retinoid), but also
revealed potential new mechanisms. Evidence for endocrine disruption (ED)
targets such as the immune system, apoptosis and tumour suppressors other
than reproduction-related functions were found; however, given the ED nature
of imposex, primary focus was on gender-differentiation pathways. Among
these, transcription factors and lipophilic nuclear receptors as transducers of
TBT toxicity along with mitochondrial functions and deregulation in transport
activity suggested new putative mechanisms for the TBT-induced imposex in N.
lapillus. Particularly, up-regulation of a putative nuclear receptor peroxisome
proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) homolog was evident, and its
role was further confirmed by inducing imposex in vivo using Rosiglizatone, a
well-known vertebrate PPARγ ligand. Our analyses show that TBT-induced
imposex is a complex mechanism, but is likely to act through the retinoid X
receptor (RXR):PPARγ heterodimer signalling pathway, hitherto not described
in invertebrates. Moreover, collectively, our findings support a commonality of
signalling between invertebrate and vertebrate species that has previously
been overlooked in the study of endocrine disruption. The genomic resources
generated here largely contribute to the molecular understanding of imposex,
yielding valuable insights for further examination of responses to TBT
contamination exposure. Additionally, we anticipate that the new genomic
resources described herein will contribute to the further exploration of adaptive
responses of dogwhelks to environmental variation.
N. lapillus was also used to explore adaptive shell shape morphology in
response to natural variation in wave-action and crab predation. Knowledge of
the contributions of genotype, plasticity and their interaction to phenotypic
expression is crucial for understanding the evolution of adaptive character traits
in heterogeneous environments. We assessed contributions of the above
factors by reciprocal transplantation of snails between two shores differing in
exposure to wave action and predation, and rearing snails of the same
provenance in a laboratory common garden experiment with crab-predation
odour, complemented by genetic analysis. The two target populations are
genetically different but maintain the same karyotype. Truss-length and
morphometric analyses revealed plasticity of shell shape in reciprocal
transplants, but also the partial retention of parental shape by F2 snails in
common garden controls, indicating co-gradient variation between heritable
and plasticity components. Crab-predation odour influenced shell shape of
snails from exposed-site origin and stimulated the production of thicker shell
lips with greater response in snails of exposed-site ancestry. We interpret these
data as countergradient variation on predator-induced changes in shell shape
and increased thickening of the shell lip as well as on growth rates.
The above exploration of gene-environment interactions demonstrates the
feasibility, insights and novel opportunities that can now be addressed in a
species that is well characterised ecologically, but hitherto constrained by the
general lack of genomic tools and archived resources. Notably, a greater focus
on detailed responses of a single species facilitates the comparative approach,
as illustrated by the apparent commonality in regulation of endocrine disruption
processes in invertebrates and vertebrates. Doutoramento em Biologia FCT FSE SFRH/BD/27711/2006
