Author(s):
Caetano, Tânia Isabel Sousa 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/3836
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Biologia; Agentes antibacterianos; Péptidos; Antibióticos; Biossíntese
Description
A estirpe Bacillus licheniformis I89 possui a capacidade de produzir alguns
compostos com actividade antibacteriana. No presente estudo, a separação
desses compostos foi realizada através da aplicação de vários procedimentos,
incluindo extracção em fase sólida e cromatografia liquida de alta pressão.
Dois destes compostos bioactivos constituem o lantibiótico de classe II
lichenicidina e são caracterizados pela massas molecular de 3250 Da (Bliα) e
3020 Da (Bliβ). O cluster responsável pela biossíntese da lichenicidina foi
heterologamente expresso em Escherichia coli, constituindo a primeira
descrição da produção de um lantibiótico totalmente in vivo num hospedeiro
Gram-negativo. Este sistema foi subsequentemente explorado com o objectivo
de relacionar cada proteína codificada no cluster genético da lichenicidina na
produção dos péptidos Bliα e Bliβ. O desenvolvimento do sistema de trans
complementação possibilitou a produção de variantes destes péptidos. A
análise das massas moleculares destas variantes assim como a análise dos
padrões de fragmentação obtidos por MS/MS permitiu a revisão de algumas
das características estruturais previamente proposta para Bliα e Bliβ. A análise
dos genes hipoteticamente envolvidos na protecção da estirpe produtora
contra a acção antibiótica da lichenicidina revelou, que em E. coli, a sua
ausência não resulta no aumento da susceptibilidade a este composto.
Verificou-se também que a presença destes genes não é essencial para a
produção de lichenicidina em E. coli. Foi também confirmado
experimentalmente que a membrana externa da E. coli constitui uma barreira
natural para a entrada dos péptidos na célula. De facto, uma das
características intrigantes da produção de lichenicidina por uma bactéria de
Gram negativo reside no mecanismo de transporte dos dois péptidos através
da membrana externa. Neste estudo foi demonstrado que na ausência da
proteína de membrana TolC, a massa molecular de Bliα e Bliβ não foi
identificada no sobrenadante de E. coli, demonstrando assim que a sua
presença no ambiente extra-celular não se devia a um processo de lise
bacteriana. Foi ainda avaliada a capacidade da maquinaria biossintética da
lichenicidina para produzir o lantibiótico haloduracina, através do
processamento de chimeras lichenicidina-haloduracina, contudo, os resultados
foram negativos. Verificou-se ainda que em determinadas condições de
incubação, a diferenciação da morfologia original da estirpe B. licheniformis I89
pode ocorrer. Esta dissociação implicou a transição da colónia parental e
rugosa para uma colónia de aparência mais simples e suave. Desta forma, as
diferenças das duas morfologias em termos de taxa de crescimento,
esporulação e actividade antibiótica foram investigadas. Considerando
especificamente Bliα e Bliβ verificou-se que a abundância destes péptidos nas
culturas do fenótipo fino é geralmente inferior aquela identificada nas culturas
do fenótipo parental. Por último, a diversidade de elementos genéticos
constituintes de péptido sintetases não ribossomais (NRPS) foi investigada em
lagoas no centro de Portugal e em solos provenientes de caves do sul de
Portugal, revelando a presença de potenciais novas NRPS nestes ambientes. Bacillus licheniformis I89 has the ability to produce some antibacterial
compounds. In the present study, the separation of such compounds was
achieved by the application of several procedures, including solid phase
extraction and preparative high-pressure liquid chromatography. Two of these
compounds constitute the class II lantibiotic lichenicidin and are characterized
by the molecular masses of 3250 Da (Bliα) and 3020 Da (Bliβ). The lichenicidin
gene cluster was successfully expressed in Escherichia coli, constituting the
first report of a complete lantibiotic gene cluster heterologous expression in a
Gram-negative host. This system was further exploited to characterize and
assign the function of the proteins encoded in the biosynthetic gene cluster.
Moreover, a trans complementation system was developed for the expression
of Bliα and Bliβ mutants in vivo. The assignment of essential amino acid
residues for bioactivity was investigated by generation of Ala-mutants. Also,
several features of Bliα and Bliβ structures were revised by analysis of MS/MS
fragmentation patterns obtained for wild type and mutated peptides. Regarding
the lichenicidin self-protection in E. coli, it was found that immunity genetic
determinants are not essential to Bliα and Bliβ production. Furthermore, it was
experimentally confirmed that the E. coli outer membrane constitutes a natural
barrier to the biological activity of lichenicidin. An intriguing feature of the
lichenicidin production by E. coli lies in the export mechanism of Bliα and Bliβ
peptides. Herein, it was demonstrated that the presence of these peptides in
the E. coli supernatants resulted from their translocation through the bacterial
cell wall. In fact, it was found that in the absence of the outer membrane protein
TolC none of the lichenicidin peptides could be detected in the bacterial
supernatants. The potential of the E. coli lichenicidin expression system to
produce the closely related lantibiotic haloduracin through the biosynthetic
processing of lichenicidin-haloduracin chimeras was also attempted in the
present study, however, without success.
It was found that under certain circumstances of incubation, B. licheniformis
I89was able to differentiate from its parental rough phenotype to a more simple
and smooth morphology. The differences in terms of growth, sporulation and
antagonistic activity of both phenotypes were investigated in two different
culture media. Regarding the production of lichenicidin peptides, it was found
that the abundance of Bliα and Bliβ in extracts from the smooth phenotype
cultivated in TSB was lower than that detected in the rough phenotype extracts.
Finally, the screening of genetic elements associated with nonribosomal
peptide synthetases was performed in Portuguese lagoons and soil from caves
using a culture-independent approach. A wide variety of adenylation domains
was identified, providing evidence that potentially novel NRPSs are present in
these environments. Doutoramento em Biologia FCT; MCTES; Laboratório Medinfar SA SFRH/BDE/15559/2005
Document Type
Doctoral Thesis
Language
English
Advisor(s)
Mendo, Sónia; Domingos, Ana Isabel Amaro Gonçalves; Moreira, Maria Júlia Caeiro Ramalho de Oliveira de Almeida
