Autor(es):
Pinto, Beatriz Lázaro 
Data: 2010
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/3515
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Biotecnologia; Plasmídeos; Filogenia; Transformação genética; Comunidades microbiológicas; Ambiente aquático - Águas superficiais
Descrição
A transferência horizontal de genes permite a adaptação microbiana a nichos
especiais, dos quais dois bons exemplos são a camada superficial do mar e a
coluna de água. Os plasmídeos com gama alargada de hospedeiros (BHR),
responsáveis pelo fluxo de material genético entre cromossomas bacterianos
(inclusivamente entre microorganismos muito afastados filogeneticamente) têm
um papel essencial na evolução das comunidades microbianas. Entre eles, os
plasmídeos pertencendo ao grupo de incompatibilidade IncP-1 têm um
interesse especial por causa da sua extraordinária flexibilidade na iniciação da
replicação e da estabilidade na sua manutenção numa ampla gama de
hospedeiros. Estes elementos genéticos móveis, além de constituírem
ferramentas úteis na engenharia genética, representam uma grande fonte de
genes que codificam para características tão significativas como a resistência
a antibióticos e a degradação de xenobióticos. No entanto, a diversidade nesta
família de plasmídeos BHR tem sido subestimada até agora: actualmente
sabe-se da existência de cinco subgrupos divergentes, mas embora alguns
plamídeos modelo tenham sido estudados ao detalhe, ainda há muito para
investigar.
Em trabalhos anteriores na Ria de Aveiro (costa NW de Portugal), foi feita a
captura exógena de plasmídeos bem como o isolamento de bactérias
potencialmente hospedeiras de plasmídeos endógenos. Neste trabalho,
sequências de nucleótidos específicas foram amplificadas mediante reacções
em cadeia da polimerase para determinar a presença de plasmídeos BHR. Os
sete plasmídeos IncP-1 detectados, foram em primeiro lugarfilogeneticamente
estudados. O alinhamento das sequências de nucleótidos de 281 pb que foram
amplificadas e que correspondem a um fragmento do gene trfA (que codifica
para uma proteína do início da replicaçao) sugeriu o estabelecimento de dois
novos clusters situados filogeneticamente em dois subgrupos diferentes de
IncP-1: IncP-1β e o recentemente descrito IncP-1ε. Estes constituem os
primeiros replicões IncP-1 provenientes de ambientes estuarinos a serem
detectados e isolados. De seguida, uma comparação e caracterização
preliminar genética e fenotípica foi realizada com os plasmídeos purificados,
considerando a descrição já conhecida dos dois plasmídeos arquétipos
evolutivamente mais próximos, pB10 e pKJK5. Assim, as análises de
fragmentos de restrição, determinação da inibição do crescimento do
hospedeiro na presença de mercúrio e ensaios de resistência a diferentes
antibióticos ajudaram a compreender o elevado interesse que recai nestes
plasmídeos revelando a diversidade fenotípica e genotípica. Uma completa
descrição de qualquer destes novos plasmídeos pode ter una enorme
importância ecológica, evolutiva e biotecnológica, incrementada pela sua
procedência dum ambiente não clínico. Portanto este trabalho justifica um
estudo em maior profundidade destes replicões promíscuos. The horizontal gene transfer allows microbial adaptation to special niches, from
which the sea-surface microlayer or the subsurface waters in estuarine
environments might be good examples. Broad host range plasmids,
responsible for the reshuffling of genetic material between bacterial
chromosomes (even amongst distantly related microorganims), play an
essential role on the evolution and diversity of microbial communities. Among
them, the incompatibility group IncP-1 plasmids have a special interest due to
their extraordinary flexibility in the replication initiation and stable maintenance
in such a wide spectrum of hosts. These mobile genetic elements, in addition to
the helpful genetic engineering tools they mean, represent a great source of
potentially useful genes encoding for traits as significant as antibiotic resistance
or xenobiotic degradation. Nevertheless, the diversity of this family of BHR
plasmids has been underestimated until recently: it is currently known to have
five divergent sub-groups, but although some prototype plasmids have been
studied in great detail, there is still much left to research.
In previous investigations exogenous plasmid capture was carried out as well
as putative endogenous plasmid bacterial hosts isolated in the Ria de Aveiro
lagoon (NW coast of Portugal). In this work, polymerase chain reactions were
developed to amplify specific nucleotide sequences and determine BHR
plasmids presence. From a bioinformatical approach, the seven IncP-1
plasmids detected were firstly phylogenetically studied. The alignment of the
amplified 281 bp nucleotide sequences corresponding to a fragment of the
replication initiation protein encoding gene trfA suggested the formation of two
novel clusters belonging to two different IncP-1 plasmid subgroups: IncP-1β
and the lately described IncP-1ε. Additionally, these represent the first
estuarine IncP-1 replicons to be detected and isolated. Then a preliminary
genetic and phenotypic comparison was performed with the purified plasmids,
by taking into account the known description of the evolutionary closest
models, pB10 and pKJK5. That way, restriction fragment analysis as well as
antibiotic and mercury resistance determination assays helped to comprehend
the high significance falling on the captured plasmids by revealing the genetic
and phenotypic diversity. A whole description of any of these novel plasmids
may have a huge ecological, evolutionary and biotechnological importance,
even more due to its precedence from a non-clinical environment. Therefore
this work justifies further studies on these promiscuous replicons. Mestrado em Biotecnologia
Tipo de Documento
Dissertação de Mestrado
Idioma
Inglês
Orientador(es)
Oliveira, Cláudia; Correia, António
