Autor(es):
Pereira, Sofia Isabel Almeida 
Data: 2010
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/3514
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Biologia; Poluição do solo; Metais pesados - Toxicidade; Ecotoxicologia; Leguminosas; Bactérias; Fixação de azoto
Descrição
Nas últimas décadas verificou-se um aumento da contaminação dos solos com
metais pesados resultante de processos antropogénicos. As descargas de
efluentes industriais, a actividade mineira e a aplicação de lamas residuais e
de fertilizantes são as principais fontes de metais pesados. Em certas regiões,
a acumulação destes elementos nos solos tem atingido níveis preocupantes
para o equilíbrio dos ecossistemas. Vários estudos têm demonstrado que os
metais influenciam os microrganismos afectando adversamente o seu
crescimento, morfologia e actividades bioquímicas resultando num decréscimo
da biomassa e diversidade. Entre os microrganismos do solo, as bactérias
pertencentes ao género Rhizobium têm um elevado interesse científico,
económico e ecológico devido à sua capacidade para fixar azoto. Deste modo,
o trabalho desenvolvido ao longo desta tese incidiu sobre o efeito da
toxicidade imposta pelos metais nas bactérias fixadoras de azoto, em
particular em Rhizobium leguminosarum bv. trifolii e teve como principais
objectivos: determinar o efeito dos metais pesados na sobrevivência e na
capacidade de fixar azoto dos isolados de rizóbio; avaliar a influência dos
metais na diversidade das populações de rizóbio isoladas de solos
contaminados; determinar os níveis de tolerância do rizóbio a diferentes
metais e analisar a resposta ao stresse oxidativo imposto pelo cádmio. A Mina
do Braçal foi o local de estudo escolhido uma vez que os seus solos estão
muito contaminados com metais em resultado da extracção de minério durante
mais de 100 anos. Foram escolhidos 3 solos com diferentes graus de
contaminação, o solo BC com concentrações reduzidas de metais, escolhido
por estar numa zona já fora da mina e designado por solo controlo e os solos
BD e BA considerados medianamente e muito contaminados,
respectivamente. O Pb e o Cd foram os metais predominantes nestes solos,
assim como o metalóide As, cujas concentrações ultrapassaram largamente
os limites previstos na lei. Sendo as enzimas do solo boas indicadoras da
qualidade do mesmo, foi determinada a actividade de algumas como a
desidrogenase (DHA) e a catalase (CAT). Ambas as enzimas correlacionaramse
negativamente com as concentrações de metais nos solos. A dimensão das
populações indígenas de rizóbio nos solos contaminados (BD e BA) foi
bastante baixa, 9,1 bactérias g-1 de solo e 7,3 bactérias g-1 de solo,
respectivamente, quando em comparação com a população do solo BC
(4,24x104 bactérias g-1 de solo). Estes resultados parecem estar relacionados
com o elevado conteúdo em metais e com o pH ácido dos solos. A capacidade
simbiótica também foi afectada pela presença de metais, uma vez que os
isolados originários do solo BD mostraram menor capacidade em fixar azoto
do que os isolados do solo controlo. A diversidade das populações de rizóbio
foi determinada com recurso à análise dos perfis de plasmídeos, perfis de REP
e ERIC-PCR de DNA genómico e perfis de proteínas e lipopolissacarídeos.
No conjunto dos 35 isolados analisados foram identificados 11 plasmídeos
com pesos moleculares entre 669 kb e 56 kb. Embora a incidência de
plasmídeos tenha sido superior nos isolados do solo BC verificou-se maior
diversidade plasmídica na população isolada do solo BD. Resultados similares
foram obtidos com os perfis de REP e ERIC-PCR e perfis de proteínas, que
indicaram maior diversidade nas populações dos solos contaminados (BD e
BA), contrariamente ao verificado por outros autores. O grau de tolerância aos
metais pesados e ao arsénio dos vários isolados testados dependeu do metal
e do local de origem. No geral, os isolados do solo BD mostraram maior
tolerância aos metais do que os isolados do solo controlo, o que está de
acordo com o esperado uma vez que geralmente as populações dos locais
contaminados são mais tolerantes. Contudo, os isolados do local mais
contaminado (BA) foram muito tolerantes apenas ao chumbo mostrando-se
sensíveis aos restantes metais. A inoculação dos solos BC, BD e BA após
irradiação com estirpes seleccionadas de rizóbio permitiu avaliar a sua
sobrevivência ao longo de 12 meses em condições mais realistas. Verificou-se
que após um decréscimo inicial, os isolados inoculados no solo BC
conseguiram recuperar a dimensão das suas populações para números
similares aos inicialmente introduzidos, contrariamente ao verificado no solo
BD onde o número de rizóbios decresceu ao longo dos 12 meses. As
condições adversas do solo BA apenas permitiram a sobrevivência de 4
isolados até aos 3 meses e apenas dois deles conseguiram sobreviver após 12
meses, designadamente C 3-1 e A 17-3. Estes isolados possuem um
plasmídeo de 669 kb que poderá estar na base da sobrevivência destas
estirpes. Por outro lado, o último isolado é originário do solo contaminado e por
isso estará também mais adaptado a sobreviver às elevadas concentrações de
Pb existentes no solo BA. Por fim, constatou-se que o cádmio, um dos metais
presente em concentrações mais elevadas nos solos em estudo, é um indutor
de stresse oxidativo nos isolados de rizóbio menos tolerantes o que foi
confirmado pelo aumento de ROS e danos celulares ao nível dos lípidos. In the last decades, an increased in soil metal contamination, resulting from
anthropogenic processes has been observed. Industrial effluent discharges,
mining activities and the applications of industrial sludge and fertilizers are the
main sources of heavy metal contamination. In some regions, the build-up of
these elements has been reaching disturbing levels that may threaten the
ecosystem’s equilibrium. Several studies showed that metals can influence
microorganisms, adversely affecting their growth, morphology and biochemical
activities, hence resulting in a decrease in biomass and diversity. Among soil
microorganisms, bacteria from the genus Rhizobium have a high scientific,
economical and ecological interest, due to their ability to fix nitrogen. Under this
context, the work developed throughout this thesis focused on the effects of
metal toxicity on nitrogen fixation bacteria, particularly in Rhizobium
leguminosarum bv. trifolii and had the following goals: to determine the effect of
heavy metals on the survival and nitrogen fixing abilities of rhizobia, evaluate
the influence of heavy metals in the diversity of Rhizobium populations isolated
from contaminated soils, to determine the levels of tolerance to different metals
and to analyze the response to the oxidative stress imposed by cadmium.
Braçal mine was the chosen study location, since their soils are very
contaminated with metals as a result of the mining extractions undertaken
during over 100 years. Three soils with different degrees of contamination were
chosen, BC soil, with reduced metal contamination, collected from the
periphery of the mine and considered the control soil and BD and BA soils, with
median and high metal contamination, respectively. Pb and Cd were the
predominant metals in these soils, as well as the metalloid As, that presented
concentrations high above the limits predicted by law. Since soil enzymes are
good indicators of soil quality, the activity of some enzymes such as
desidrogenase (DHA) and catalase (CAT) were studied. Both enzymes were
negatively correlated with soil metal concentrations. The dimension of
Rhizobium indigenous populations in the contaminated soils (BD and BA) was
very low, 9.1 bacteria g-1 soil and 7.3 bacteria g-1soil, respectively, in
comparison to BC soil (4.24x104 bacteria g-1 soil). These results seem to be
related to the high metal content and the acid pH of soils. The symbiotic ability
was also affected by metal contamination, since the isolates from BD soils
showed a lower ability to fix nitrogen when compared to controls. The diversity
of Rhizobium populations was determined with plasmid profile analysis, REP
and ERIC-PCR from genomic DNA and protein and lipopolysaccharide profiles.
From the 35 analyzed isolates, 11 plasmids were identified, with molecular
weights ranging from 669 and 56 kb. Although plasmid incidence was higher on
BC soils isolates, higher plasmid diversity was observed in BD isolates.
Similar results were obtained with REP and ERIC-PCR and protein profiles
which indicated a higher diversity of populations isolated from the contaminated
soils (BD and BA), which was contrary to results observed by other authors.
Isolate metal tolerance levels was dependent on the metal and strain origin.
Generally, isolates from BD soils showed higher metal tolerance than control
isolates, as was expected, since populations from contaminated soils usually
present higher tolerance. Nonetheless, the isolates from the most contaminated
soil (BA) presented higher tolerance to Pb but high sensitivity to the other
metals. The inoculation of soils BC, BD and BA after irradiation, with selected
Rhizobium strains allowed us to evaluate their survival throughout 12 months in
more realistic conditions. It was observed that after an initial decrease, isolates
from BC soils were able to recover the size of their populations the initial
population sizes, unlike BD soils, where the number of Rhizobium cells
decreased throughout the 12 months. The adverse conditions in BA soils only
allowed the survival of 4 isolates up to 3 months and only two were able to
survive the 12 months (C 3-1 and A 17-3). These isolates presented a 669 kb
plasmid that could be the basis of these strain’s survival. Moreover, the strain
A17-3 was isolated from the contaminated soil and for this reason could be
more adapted and survive to high concentrations of Pb presented in BA soil.
Finally, it was observed that cadmium, one of the metals presented in higher
concentrations in soils, is an inducer of oxidative stress in the less tolerant
Rhizobium isolates, which was confirmed by ROS increase and lipid cellular
damage. Doutoramento em Biologia FCT / FSE SFRH/BD/18843/2004
