Autor(es):
Alves, Renato Manuel Pereira 
Data: 2008
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/3012
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Métodos biomoleculares; Mitocôndria; Proteómica; Sistema músculo-esquelético; Envelhecimento
Descrição
Este trabalho teve como objectivo determinar de que forma o envelhecimento
afecta o proteoma mitocondrial do músculo-esquelético. Para tal, foram
analisadas (i) alterações na composição (ii) variações da actividade dos
complexos da cadeia respiratória, (iii) a oxidação de proteínas mitocondriais e
(iv) os locais específicos de oxidação dos Complexo I da Cadeia de Transporte
de Electrões (ETC). Simultaneamente, verificou-se de que forma o estilo de
vida sedentário vs. não-sedentário pode condicionar cada um dos parâmetros
observados. Para atingir estes objectivos ratinhos C57BL/6 machos foram
sujeitos a um protocolo para simular o envelhecimento sedentário e
não-sedentário. Os animais foram depois sacrificados e isoladas as
mitocôndrias dos músculos dos membros traseiros. As proteínas mitocondriais
foram depois separadas por 2D-PAGE e identificadas por espectrometria de
massa. Após a comparação dos perfis de 2D-PAGE pode-se observar que a
maioria das proteínas analisadas se encontra sobre-representadas no
proteoma mitocondrial de ratinhos sedentários. Para avaliar se estas
diferenças se correlacionavam com eventuais alterações na actividade dos
complexos da cadeira respiratória, estes foram separados por BN-PAGE e
corados com soluções específicas para determinar a sua actividade.
Verificou-se uma diminuição na actividade dos complexos IV e V da cadeia
respiratória que parece indicar que o aumento da quantidade de proteínas dos
complexos da ETC no proteoma mitocondrial surge como um mecanismo de
compensação para suprimir a diminuição da actividade da cadeia respiratória.
Como parâmetro de oxidação proteica foi determinado o conteúdo em grupos
carbonilos das amostras por slot blot. Verificou-se que há uma diminuição
significativa do conteúdo em grupos carbonilos nas proteínas dos ratinhos que
foram sujeitos a um estilo de vida não-sedentário. Para determinar os locais de
oxidação do Complexo I da ETC, as sete subunidades deste complexo,
identificadas previamente, foram sujeitas a espectrometria de massa tandem.
Foram detectadas modificações em vários péptidos, sendo os resíduos de
triptofano mais afectados pela oxidação. Contrariamente ao esperado, as
subunidades membranares apresentaram-se mais modificadas que as
subunidades mais próximas do centro catalítico. Os resultados permitem
sugerir que as subunidades membranares são mais tolerantes aos efeitos da
oxidação e que as subunidades do Complexo I podem ser substituídas
individualmente quando são danificadas pelos efeitos da oxidação.
Globalmente podemos concluir que a realização de actividade física moderada
previne os efeitos do envelhecimento, nomeadamente a nível de danos
oxidativos nas proteínas mitocondriais.
ABSTRACT: This work aimed to assess how aging influences the skeletal muscle
mitochondrial proteome. To achieve this, we have analyzed (i) alterations on its
composition, (ii) variations on the activity of the respiratory chain complexes,
(iii) the oxidation of mitochondrial proteins and (iv) the specific sites for
oxidative modification on Complex I from the Electron Transport Chain (ETC).
Simultaneously, we assessed how these parameters may be conditioned by a
sedentary vs. a non-sedentary lifestyle. C57BL/6 male mice were subjected to
a protocol to simulate sedentary and non-sedentary aging. The animals were
then sacrificed and mitochondria from the hind limbs muscles were isolated.
Mitochondrial proteins were resolved by 2D-PAGE and identified by mass
spectrometry. Following a comparison of the 2DE profiles, we have observed
that most of the analyzed proteins were up-regulated in sedentary mice
mitochondrial proteome. To assess if these alterations were related to any
functional variations, the respiratory chain complexes were resolved by
BN-PAGE and differentially stained to determine the in-gel activity. We
observed a reduction of the activity of Complexes IV and V in sedentary mice,
which may suggest that the up-regulation of the respiratory chain complexes in
sedentary mice may be a mechanism to overcome the loss of functionality. To
assess the level of oxidative stress, we have determined the carbonyl content
by slot blot and observed a significant decrease in the carbonyl content of
non-sedentary mice. To locate the precise sites for oxidative damage in
Complex I of the ETC, the seven subunits of this complex, previously isolated
by 2D-PAGE, were subjected to tandem mass spectrometry. We have detected
several modified peptides, with tryptophan being the most affected residue.
Unexpectedly the membrane subunits presented more modification sites than
the peripheral arm subunits. These results may suggest that membrane
subunits are more tolerant to oxidative damage and Complex I subunits may be
replaced by newly synthesized ones when oxidative damage becomes
unbearable. In conclusion, we may assume that moderate physical activity
attenuates the effects of aging, namely the oxidative damage of mitochondrial
proteins. Mestrado em Métodos Biomoleculares
Tipo de Documento
Dissertação de Mestrado
Idioma
Inglês
Orientador(es)
Amado, Francisco Manuel Lemos; Ferreira, Rita Maria Pinho
