Autor(es):
Pires, Liliana Raquel Fernandes 
Data: 2007
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10773/2250
Origem: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Assunto(s): Engenharia biomédica; Biomateriais; Nanopartículas; Terapia genética
Descrição
O quitosano é um policatião de origem natural que tem vindo a ser investigado
como sistema não viral de vectorização de genes devido à sua
biocompatibilidade e baixa toxicidade. No entanto, a sua baixa eficiência de
transfecção tem dificultado o seu uso generalizado. Num estudo anterior
mostrámos que a conjugação de resíduos de imidazol a cadeias de quitosano
resulta numa melhoria da eficiência de transfecção do polímero. O principal
objectivo deste estudo foi avaliar a aplicação de quitosano modificado com
imidazol (CHimi) como vector para entrega de genes em medicina
regenerativa, bem como encontrar novas vias para melhorar a eficiência.
A expressão genética mediada por CHimi com dois graus de substituição -
13% e 22% das aminas primárias do quitosano - foi avaliada em células 293T
(células embrionárias humanas do epitélio do rim) por um período de 8 dias,
usando o gene da β-Galactosidase (β-gal) como gene repórter. Os complexos
de CHimi-DNA foram preparados numa razão molar de 18 entre aminas
primárias e grupos fosfato. As células transfectadas com estes complexos
apresentam um pico de actividade da β-gal às 72 horas pós-transfecção,
verificando-se a expressão sustentada da proteína repórter durante todo o
período de avaliação. Nestas condições a viabilidade celular não é
comprometida. Quando se efectua um segundo tratamento das células com
complexos à base de CHimi, a actividade de transfecção volta a aumentar,
sem haver alterações na viabilidade celular. Verificou-se também que células
transfectadas com estes vectores sobrevivem a um ciclo de
congelação/descongelação, mantendo uma actividade de transfecção
sustentada no tempo. Uma polietilenimina comercial (Escort V) foi usada como
referência neste estudo. Apesar de os níveis de transfecção mediados por este
vector serem duas ordens de grandeza mais elevados, a viabilidade celular
decresce até aos 50% após cada tratamento.
De forma a investigar o processo de transfecção mediado por polímeros de
CHimi, o tráfego intracelular destes complexos foi estudado por microscopia
confocal de varrimento laser. Complexos de CHimi e DNA marcados com
fluoróforos foram encontrados no citoplasma celular 2 horas depois da
transfecção, sendo detectados até 48 horas pós-transfecção. Estes resultados
podem em parte explicar a expressão sustentada de β-gal ao longo do tempo.
Os complexos foram detectados no interior do núcleo 4 horas pós-transfecção.
O DNA marcado com fluorescência não foi observado na forma livre em
nenhum dos momentos analisados, enquanto que CHimi foi detectado num
evento único no citoplasma. Num ensaio “cell-free” de transcrição/tradução in
vitro não foi detectada a síntese de proteína quando o DNA estava
complexado com CHimi, apesar de este ser expresso na ausência do
polímero. Este conjunto de resultados sugere que, apesar dos complexos
poderem ser encontrados no interior do núcleo rapidamente após a
transfecção, a expressão genética parece depender da desintegração do
complexo. O CHimi é um potencial candidato a vector para transporte de
genes num cenário de regeneração. Este material medeia uma expressão
proteica sustentada sem afectar a viabilidade celular. Com este sistema, as
células toleram uma segunda adição de complexos, pelo que a administração
repetida poderá ser potencialmente usada como estratégia para prolongar o
efeito terapêutico de uma proteína de interesse. Em relação aos resultados de
tráfego intracelular dos complexos, e considerando o perfil de expressão
genética obtido, pode pôr-se a hipótese de que a expressão sustentada do
gene resulta de um processo de libertação dependente do tempo. Neste
sentido, ajustar a velocidade de degradação dos polímeros de CHimi pode ser
usado como estratégia para melhorar o processo de expressão do gene tendo
em vista o fim terapêutico pretendido.
ABSTRACT: Chitosan is a polycation of natural origin, emerging in the non-viral gene
delivery vectors scene due to its biocompability and low cytotoxicity. However,
its low transfection efficiency has hampered its wide application so far. We
have previously shown that grafting imidazole moieties into the chitosan
backbone results in improved transfection efficiency of this polymer. The main
goal of this study was to assess the application of imidazole-grafted chitosan
(CHimi) as gene delivery vector in a regenerative medicine scenario and to find
avenues to further improve its efficiency.
Gene expression mediated by CHimi with two degrees of substitution - 13%
and 22% of chitosan primary amines - was assessed in 293T cells for periods
up to 8 days, using the β-Galactosidase (β-gal) gene as reporter gene. CHimi-
DNA complexes were prepared at a primary amine to phosphate groups molar
ratio of 18. Cells transfected with the CHimi-based complexes have a peak of
β-gal activity 72 hours post-transfection and show a sustained β-gal production
for 8 days. During this time period cell viability is not impaired. When a second
treatment with CHimi-based complexes is performed, transfection activity
increases, without changes on cell viability. Additionally, cells transfected with
CHimi-based vectors are able to withstand a freeze/thawing cycle, maintaining
a sustained transfection activity. A commercially available polyethylenimine
(Escort V) was used as a reference. Though transfection levels are two orders
of magnitude higher, cell viability decreases up to 50% after each treatment.
In order to investigate the transfection process mediated by CHimi-based
vectors a study of the intracellular pathway of the complexes has been
performed by confocal laser scanning microscopy. Complexes formed by
fluorescently labeled CHimi and DNA were found inside the cell cytoplasm 2
hours after transfection and were detected up to 48 hours post-transfection.
These results could explain in part the sustained gene expression over time.
Complexes were detected inside cell nucleus since 4 hours post-transfection.
Fluorescently labeled DNA in the free form was not observed at any of the time
points analyzed. Free CHimi was detected in the cytoplasm in an atypical
event. In a cell-free in vitro transcription/translation assay no protein production
was detected when DNA was complexed with CHimi, though expressed when
using plasmid DNA in the absence of CHimi. Taken together these results
suggest that, though CHimi-based complexes can be detected inside cell
nucleus promptly after transfection, gene expression is dependent on the
complex disassembling.
CHimi is a potential candidate vector for gene delivery in a regenerative
scenario. This material is able to mediate a sustained protein expression
without impairing cell viability. In our system, cells can sustain another addition
of the complexes suggesting that repeated administration could be used as a
strategy to prolong the therapeutic effect. In view of the trafficking results and
considering the gene expression profile, one can hypothesize that the observed
sustained transgene expression is a time dependent release process. Thus,
tuning the degradation rate of CHimi-based polymers could be a strategy to
further improve the overall transgene expression process to fulfill the
therapeutic end. Mestrado em Engenharia Biomédica - Biomateriais
Tipo de Documento
Dissertação de Mestrado
Idioma
Inglês
Orientador(es)
Pêgo, Ana Paula Gomes Moreira; Santos, Manuel
