Author(s):
Eira, Dânia Marques 
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/10083
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Microbiologia; Aeromonas; Resistência a antibióticos; Mutagénese
Description
Espécies de Aeromonas são reconhecidas como agentes etiológicos de amplo
espetro de doenças em humanos e animais. São muito comuns em águas de
consumo e em diferentes tipos de alimentos, especialmente frutos do mar. A
resistência de Aeromonas spp. aos antibióticos vulgarmente usados, é um
assunto de preocupação, devido à natureza ubíqua desses organismos. A
resistência a antibióticos em Aeromonas está relacionada com vários
mecanismos, ao passo que, a resistência codificada cromossomicamente por
β-lactâmicos é particularmente relevante devido à ampla utilização destes
antibióticos. A expressão coordenada de β-lactamases induzidas
cromossomicamente é considerada o mecanismo principal de resistência a β-
lactâmicos, em Aeromonas sp. No entanto, os mecanismos precisos da sua
regulamentação ainda não estão claros.
O objetivo deste estudo é a elaboração de uma biblioteca de mutantes para A.
hydrophila, com o intuito de identificar novos determinantes genéticos que
possam estar envolvidos na regulação do mecanismo de resistência a
antibióticos β-lactâmicos, podendo constituir novos alvos de aplicação
terapêutica.
Os mutantes obtidos foram testados para a suscetibilidade aumentada ou
diminuída à ampicilina, cefotaxima e imipenemo. O perfil de sensibilidade foi
medido por microdiluição. Uma vez que, foi demonstrado que as células em
biofilmes são geralmente mais resistentes à quimioterapia do que as células
planctónicas, os mutantes também foram avaliados quanto à sua capacidade
de formar biofilmes num ensaio em placa de microtitulação utilizando
coloração com violeta de cristal.
Esta abordagem permitiu a identificação de 17 mutantes que apresentam
fenótipos de resistência alterados: 5 mutantes mostraram aumentar a
suscetibilidade ao IMP, 11 apresentaram diminuição da suscetibilidade à CTX
e 1 mutante, quando comparado com a estirpe parental, mostrou aumento da
suscetibilidade ao IMP e diminuição da suscetibilidade à CTX. Além disso,
todos os 17 mutantes apresentaram também alterações reprodutíveis na sua
capacidade de formação de biofilme.
Por sequenciação da região que flanqueia o transposão de 4 mutantes, foram
identificados os genes seguintes que codificam proteínas envolvidas na
resistência a β-lactâmicos: uma proteína reguladora da transcrição, uma
ATPase, uma GDP-manose 4,6-desidratase e uma proteína hipotética com
função desconhecida. Aeromonas species are recognized as etiological agents of a wide spectrum
of diseases in humans and animals. They are very common in drinking
waters and in different types of foods, particularly seafood. Resistance of
Aeromonas spp. to commonly used antibiotics is a matter of concern due to
the ubiquitous nature of these organisms. Antibiotic resistance in
Aeromonas is related to several in which the chromosomally encoded
resistance to β-lactams is particularly relevant due to the wide use of these
antibiotics. The coordinated expression of chromosomally inducible β-
lactamases is considered a main mechanism of resistance to β-lactams in
Aeromonas sp. Nevertheless, the precise mechanisms of its regulation are
still unclear.
The objective of this study is to develop a library of mutants of A. hydrophila,
in order to identify new genetic determinants that could be involved in
regulation mechanism of resistance to β-lactam antibiotics, and may
constitute novel targets for therapeutic application.
The mutants obtained were screened for either increased or decreased
susceptibility to ampicillin, cefotaxime and imipenem. The susceptibility
profile was measured by broth dilution. Since it has been shown that cells in
biofilms are generally more resistant to antimicrobial chemotherapies than
planktonic cells, the mutants were also evaluated for their ability to form
biofilms in a microtitre plate assay using crystal violet staining.
This approach allowed the identification of 17 mutants presenting altered
resistance phenotypes: 5 mutants revealed to increase the susceptibility to
imipenem, 11 showed reduction of the susceptibility to cefotaxime and 1
mutant, when compared with the parental lineage, showed an increase of
susceptibility to imipenem and a decrease of susceptibility to cefotaxime.
Futhermore, all the 17 mutants also presented reproducible alterations in
their capability of biofilm formation.
By sequencing the transposon flanking region of 4 mutants, the following
genes encoding proteins involved in the resistance to β-lactams were
identified: a transcriptional regulatory protein, an ATPase, a GDP-mannose
4,6-dehydratase and a hypothetical protein with unknown function. Mestrado em Microbiologia
Document Type
Master Thesis
Language
Portuguese
Advisor(s)
Correia, António Carlos Matias; Duarte, Ana Sofia Direito dos Santos
