Autor(es):
Cunha, Ana 
Data: 2001
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/1822/3336
Origem: RepositóriUM - Universidade do Minho
Detalhes do Documento
Ontogénese lipídica associada à embriogénese somática e ao crescimento de cultu...
Descrição
Tese de doutoramento em Ciências. Culturas in vitro de linho (Linum usitatissimum L.) foram estabelecidas em meio sólido de Murashige e Skoog (MS) (1). A formação de callus e a sua capacidade morfogénica foram testadas em diferentes tipos de explante primário e os efeitos de diferentes combinações hormonais na indução de calli, organogénese e embriogénese somática foram estudados. Para as condições testadas, a combinação hormonal ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) + zeatina (ZEA) foi a mais eficiente na indução e crescimento de calli. Este apresentou-se clorofilino, compacto e sem capacidade rizogénica. Em contraste, em concentrações semelhantes, ácido 3-indole-butírico (IBA) + cinetina (KIN) induziram calli friáveis, esbranquiçados, com boa capacidade rizogénica (60 %). Uma experiência factorial incompleta onde se testaram diferentes combinações de 2,4-D + ZEA + ácido giberélico (GA3), a diferentes níveis, revelou que a direcção de diferenciação do explante era determinada por interacções e concentrações específicas dos reguladores de crescimento. Os resultados desta experiência mostraram que a via organogénica (diferenciação de raízes versus diferenciação de rebentos caulinares) pode ser manipulada nos explantes de linho aumentando o nível de 2,4-D de 0,05 a 3,2 mg/l no meio de indução. A indução e desenvolvimento de embriões somáticos foi possível numa gama de concentrações de 2,4-D + ZEA na vizinhança de 0,4 e 1,6 mg/l, sendo esta combinação a mais eficiente. Com o objectivo de optimizar o processo de embriogénese somática a partir de explantes subcotiledonares de linho, o tipo de explante primário mais adequado para esta finalidade, os efeitos de diferentes tipos e concentrações de fonte de carbono, concentração de azoto inorgânico total, proporção entre nitrato (NO3 -) e amónio (NH4 +), e interação entre diferentes concentrações de cálcio e ZEA foram estudados em 3 experiências factoriais completas. Meio MS (1) suplementado com os monossacarídeos glucose e frutose em elevadas concentrações (4 %) deram consistentemente culturas altamente embriogénicas, com elevada produção de embriões somáticos (ES) e elevadas taxas de crescimento, quando comparadas com meios suplementados com sacarose ou maltose. Embora a suplementação com maltose tenha dado bons resultados numa gama de concentrações de 1-4 %, o meio suplementado com 4 % de sacarose inibiu a indução e o desenvolvimento de ES. A relação entre as formas iónicas desempenhou um papel determinante na indução de embriogénese somática e no crescimento dos ES. O nitrato foi importante para o crescimento de calli ao passo que, para uma elevada produção de ES, foi importante uma elevada concentração de ião amónio. O compromisso entre o crescimento de calli indiferenciado e a embriogénese somática foi determinado por uma interacção entre níveis de cálcio e ZEA muito específica. Uma alta concentração de cálcio associada a uma baixa concentração de ZEA resultou em baixo potencial embriogénico e elevada produção de calli. Uma elevada concentração de ZEA foi essencial para o desenvolvimento dos ES. Usando uma suplementação hormonal para co-indução de embriogénese somática e caulogénese a partir de explantes de hipocótilo de linho foi possível realizar um estudo comparativo, através de análise em GC e GC-MS, sobre o teor e composição de esteróis livres em calli nãomorfogénicos, caulogénicos e embriogénicos, bem como em rebentos caulinares e ES. Deste estudo constatou-se que ocorria um aumento no teor de esteróis livres nos calli morfogenicamente competentes e um aumento na razão estigmasterol/β-sitosterol nas estruturas regeneradas. Em contrapartida, em calli não-morfogénicos, esta razão diminuiu durante a respectiva fase exponencial de crescimento devido ao aumento drástico de β-sitosterol. Este efeito, tal como o crescimento de calli, foi maior com 0,5 mg/l de 2,4-D do que com 0,6 mg/l de IBA. O conteúdo das fracções totais, neutras e ácidas dos extractos lipídicos bem como os conteúdos e composições das fracções de n-alcanos, ácidos gordos livres e esterificados, de amostras obtidas em diferentes estágios de desenvolvimento de culturas embriogénicas, foram estudados por GC e GC-MS. Durante a indução e desenvolvimento de callus a partir de segmentos subcotiledonares constatou-se que a percentagem de lípidos totais diminuía. Em todos os tipos de tecido – segmentos sub-cotiledonares (SH), SH com callus nas superfícies de corte (SHC), calli embriogénicos (CE), não-embriogénicos (CNE) e embriões somáticos (ES) – foi encontrada uma distribuição de n-alcanos tipo normal assimétrica na gama C13-C21. O teor mais elevado ocorreu nos explantes primários (SH) e em SHC. Alcanos de cadeia mais longa foram observados apenas em tecidos diferenciados tais como hipocótilos e ES. Nos calli e ES o teor destes compostos diminuiu com o tempo, tendo essa diminuição sido mais significativa em CE que em CNE, independentemente do tempo em cultura. Este resultado sugere a utilização de nalcanos para o crescimento celular e a sua mobilização dos CE para os ES emergentes. As análises estatísticas e multivariadas utilizadas para a análise dos resultados obtidos para as fracções ácidas revelaram que ocorreu um incremento acentuado no teor em ácidos gordos (AG) (livres e esterificados) associada com a indução e desenvolvimento de calli. Diferenças significativas relaccionadas com a capacidade embriogénica, com a fase de crescimento de calli e com a fase de desenvolvimento dos ES em cultura foram também registadas. Culturas diferentes apresentaram diferentes composições em AG. O padrão de variação das razões 18:3/18:2 e 18:0/18:3 sugere que estas possam ser utilizadas como potenciais marcadores da capacidade fotoautotrófica de ES e da capacidade embriogénica de calli, respectivamente. 1. Murashige T. e Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497. In vitro cultures of flax (Linum usitatissimum L. ) were established on basal Murashige and Skoog (MS) (1) medium. The morphogenic and callus formation capacity were assessed for different types of flax explant sources and the effects of plant growth regulators (PGR) on calli induction, organogenesis and somatic embryogenesis were studied. Under the experimental conditions tested, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) + zeatin (ZEA) was the most efficient PGR combination on calli induction and biomass production. The calli were green but with no rhizogenic capacity. In contrast, and at similar concentrations, indole-3-butyric acid (IBA) + kinetin (KIN) induced white or pale green friable calli with a good root regeneration capacity (60 %). A factorial experiment with different combinations of 2,4-D + ZEA + gibberellic acid (GA3) levels revealed that the direction of explant differentiation was determined by specific PGR interactions and concentrations. The results from these experiments revealed that the organogenic pathway (shoot versus root differentiation) can be manipulated on flax explants by raising the 2,4-D level from 0.05 to 3.2 mg/l in the induction medium. The induction and the development of somatic embryos from explants was possible in a range of 2,4-D + ZEA concentrations surrounding 0.4 mg/l 2,4-D and 1.6 mg/l ZEA, the most efficient growth regulator combination for this purpose. Having in view the optimization of the somatic embryogenesis process from flax hypocotyl explants, the best type of primary explant from those tested for this purpose, the effects of different types and levels of carbon source, total inorganic nitrogen concentration, nitrate to ammonium ratio and the interaction between calcium and ZEA levels were studied in three independent factorial experiments. MS medium supplemented with the monosaccharides glucose and fructose at high concentrations (4 %) gave consistently highly embryogenic cultures, with higher somatic embryo frequences and higher growth rates when compared with media supplemented with sucrose and maltose. Although media with maltose had performed well in a 1-4 % concentration range, media supplemented with sucrose at 4 %, appeared to inhibit the induction and development of somatic embryos. Independently of the effect of the nitrogen content, the balance between both ionic forms (NO3 - and NH4 +) played a dramatic role on the induction of somatic embryogenesis and somatic embryo growth. Nitrate is important for calli differentiation and growth, and a high ammonium content increased somatic embryo frequency. The embryogenic vs. undifferentiated cell growth commitment of flax explants was determined by interaction between calcium and ZEA levels, a high calcium/low ZEA affording very low embryogenic potential and high calli biomass. A high ZEA concentration was essential for the normal development of somatic embryos. Using a single medium hormonal variant for induction and development of somatic embryogenesis and shoot organogenesis from flax hypocotyls, a comparative study was performed, through analysis by GC and GC-MS, to determine the free sterols content and composition in non-morphogenic, shoot organogenic and embryogenic calli as well as in regenerated shoots and somatic embryos. The induction of somatic embryogenesis and shoot organogenesis of flax was associated with an increase of total sterols in the competent calli and an increased ratio of stigmasterol to β-sitosterol in derived embryos and shoots. On the contrary, in non-morphogenic calli, the ratio stigmasterol to β-sitosterol decreased during the exponential growth phase due to a drastic rise in the β-sitosterol content. This effect as well as the calli growth were higher with 0.5 mg/l 2,4-D than with 0.6 mg/l IBA. The content of total, neutral and acid fractions of lipidic extracts as well as the contents and composition of hydrocarbons, esterified and free fatty acids fractions, sampled at different developmental stages, were studied by GC and GC-MS. During induction and development of callus from hypocotyl tissues, a decrease in the percentage of total lipids was observed. In all types of tissue sampled - hypocotyl segments (SH) used as primary explants, SH with differentiating calli at the cut ends (SHC), embryogenic (CE) and non-embryogenic calli (CNE) and somatic embryos (ES) – a skewed-normal distribution of n-alkanes with a low mass range (C13-C21) was found. The highest content of n-alkanes occurred in the primary hypocotyl explant and in the early stages of callus development. Longer carbon chain n-alkanes were observed only in the mature or differentiated tissues of hypocotyls and ES. Although the n-alkane contents decreased with time, in ES and calli, a significant lower n-alkane content was observed in CE when compared to CNE independent of time in culture. These results suggest the utilisation of n-alkanes for heterotrophic cellular growth as well as its mobilisation from CE to developing ES. The statistical and multivariate analyses performed to analyse the bulk results obtained for the fatty acid fractions revealed that there was a high increment in the AG content (free and sterified) associated with the induction and development of calli from SH explants. Significant differences related to calli embriogenic capacity and growth phase and to the development of somatic embryos in culture were also found. Various groups of fatty acids, namely, polyunsaturated fatty acids, very long chain and medium chain fatty acids were responsible for those differences. Different cultures have shown distinct AG compositions. The variation pattern presented by 18:3/18:2 and 18:0/18:3 suggest a role for these ratios as markers of ES photoautotrophy and calli growth phase and of calli embryogenic capacity, respectively. 1. Murashige T. e Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497.
Tese de doutoramento em Ciências. Culturas in vitro de linho (Linum usitatissimum L.) foram estabelecidas em meio sólido de Murashige e Skoog (MS) (1). A formação de callus e a sua capacidade morfogénica foram testadas em diferentes tipos de explante primário e os efeitos de diferentes combinações hormonais na indução de calli, organogénese e embriogénese somática foram estudados. Para as condições testadas, a combinação hormonal ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) + zeatina (ZEA) foi a mais eficiente na indução e crescimento de calli. Este apresentou-se clorofilino, compacto e sem capacidade rizogénica. Em contraste, em concentrações semelhantes, ácido 3-indole-butírico (IBA) + cinetina (KIN) induziram calli friáveis, esbranquiçados, com boa capacidade rizogénica (60 %). Uma experiência factorial incompleta onde se testaram diferentes combinações de 2,4-D + ZEA + ácido giberélico (GA3), a diferentes níveis, revelou que a direcção de diferenciação do explante era determinada por interacções e concentrações específicas dos reguladores de crescimento. Os resultados desta experiência mostraram que a via organogénica (diferenciação de raízes versus diferenciação de rebentos caulinares) pode ser manipulada nos explantes de linho aumentando o nível de 2,4-D de 0,05 a 3,2 mg/l no meio de indução. A indução e desenvolvimento de embriões somáticos foi possível numa gama de concentrações de 2,4-D + ZEA na vizinhança de 0,4 e 1,6 mg/l, sendo esta combinação a mais eficiente. Com o objectivo de optimizar o processo de embriogénese somática a partir de explantes subcotiledonares de linho, o tipo de explante primário mais adequado para esta finalidade, os efeitos de diferentes tipos e concentrações de fonte de carbono, concentração de azoto inorgânico total, proporção entre nitrato (NO3 -) e amónio (NH4 +), e interação entre diferentes concentrações de cálcio e ZEA foram estudados em 3 experiências factoriais completas. Meio MS (1) suplementado com os monossacarídeos glucose e frutose em elevadas concentrações (4 %) deram consistentemente culturas altamente embriogénicas, com elevada produção de embriões somáticos (ES) e elevadas taxas de crescimento, quando comparadas com meios suplementados com sacarose ou maltose. Embora a suplementação com maltose tenha dado bons resultados numa gama de concentrações de 1-4 %, o meio suplementado com 4 % de sacarose inibiu a indução e o desenvolvimento de ES. A relação entre as formas iónicas desempenhou um papel determinante na indução de embriogénese somática e no crescimento dos ES. O nitrato foi importante para o crescimento de calli ao passo que, para uma elevada produção de ES, foi importante uma elevada concentração de ião amónio. O compromisso entre o crescimento de calli indiferenciado e a embriogénese somática foi determinado por uma interacção entre níveis de cálcio e ZEA muito específica. Uma alta concentração de cálcio associada a uma baixa concentração de ZEA resultou em baixo potencial embriogénico e elevada produção de calli. Uma elevada concentração de ZEA foi essencial para o desenvolvimento dos ES. Usando uma suplementação hormonal para co-indução de embriogénese somática e caulogénese a partir de explantes de hipocótilo de linho foi possível realizar um estudo comparativo, através de análise em GC e GC-MS, sobre o teor e composição de esteróis livres em calli nãomorfogénicos, caulogénicos e embriogénicos, bem como em rebentos caulinares e ES. Deste estudo constatou-se que ocorria um aumento no teor de esteróis livres nos calli morfogenicamente competentes e um aumento na razão estigmasterol/β-sitosterol nas estruturas regeneradas. Em contrapartida, em calli não-morfogénicos, esta razão diminuiu durante a respectiva fase exponencial de crescimento devido ao aumento drástico de β-sitosterol. Este efeito, tal como o crescimento de calli, foi maior com 0,5 mg/l de 2,4-D do que com 0,6 mg/l de IBA. O conteúdo das fracções totais, neutras e ácidas dos extractos lipídicos bem como os conteúdos e composições das fracções de n-alcanos, ácidos gordos livres e esterificados, de amostras obtidas em diferentes estágios de desenvolvimento de culturas embriogénicas, foram estudados por GC e GC-MS. Durante a indução e desenvolvimento de callus a partir de segmentos subcotiledonares constatou-se que a percentagem de lípidos totais diminuía. Em todos os tipos de tecido – segmentos sub-cotiledonares (SH), SH com callus nas superfícies de corte (SHC), calli embriogénicos (CE), não-embriogénicos (CNE) e embriões somáticos (ES) – foi encontrada uma distribuição de n-alcanos tipo normal assimétrica na gama C13-C21. O teor mais elevado ocorreu nos explantes primários (SH) e em SHC. Alcanos de cadeia mais longa foram observados apenas em tecidos diferenciados tais como hipocótilos e ES. Nos calli e ES o teor destes compostos diminuiu com o tempo, tendo essa diminuição sido mais significativa em CE que em CNE, independentemente do tempo em cultura. Este resultado sugere a utilização de nalcanos para o crescimento celular e a sua mobilização dos CE para os ES emergentes. As análises estatísticas e multivariadas utilizadas para a análise dos resultados obtidos para as fracções ácidas revelaram que ocorreu um incremento acentuado no teor em ácidos gordos (AG) (livres e esterificados) associada com a indução e desenvolvimento de calli. Diferenças significativas relaccionadas com a capacidade embriogénica, com a fase de crescimento de calli e com a fase de desenvolvimento dos ES em cultura foram também registadas. Culturas diferentes apresentaram diferentes composições em AG. O padrão de variação das razões 18:3/18:2 e 18:0/18:3 sugere que estas possam ser utilizadas como potenciais marcadores da capacidade fotoautotrófica de ES e da capacidade embriogénica de calli, respectivamente. 1. Murashige T. e Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497. In vitro cultures of flax (Linum usitatissimum L. ) were established on basal Murashige and Skoog (MS) (1) medium. The morphogenic and callus formation capacity were assessed for different types of flax explant sources and the effects of plant growth regulators (PGR) on calli induction, organogenesis and somatic embryogenesis were studied. Under the experimental conditions tested, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) + zeatin (ZEA) was the most efficient PGR combination on calli induction and biomass production. The calli were green but with no rhizogenic capacity. In contrast, and at similar concentrations, indole-3-butyric acid (IBA) + kinetin (KIN) induced white or pale green friable calli with a good root regeneration capacity (60 %). A factorial experiment with different combinations of 2,4-D + ZEA + gibberellic acid (GA3) levels revealed that the direction of explant differentiation was determined by specific PGR interactions and concentrations. The results from these experiments revealed that the organogenic pathway (shoot versus root differentiation) can be manipulated on flax explants by raising the 2,4-D level from 0.05 to 3.2 mg/l in the induction medium. The induction and the development of somatic embryos from explants was possible in a range of 2,4-D + ZEA concentrations surrounding 0.4 mg/l 2,4-D and 1.6 mg/l ZEA, the most efficient growth regulator combination for this purpose. Having in view the optimization of the somatic embryogenesis process from flax hypocotyl explants, the best type of primary explant from those tested for this purpose, the effects of different types and levels of carbon source, total inorganic nitrogen concentration, nitrate to ammonium ratio and the interaction between calcium and ZEA levels were studied in three independent factorial experiments. MS medium supplemented with the monosaccharides glucose and fructose at high concentrations (4 %) gave consistently highly embryogenic cultures, with higher somatic embryo frequences and higher growth rates when compared with media supplemented with sucrose and maltose. Although media with maltose had performed well in a 1-4 % concentration range, media supplemented with sucrose at 4 %, appeared to inhibit the induction and development of somatic embryos. Independently of the effect of the nitrogen content, the balance between both ionic forms (NO3 - and NH4 +) played a dramatic role on the induction of somatic embryogenesis and somatic embryo growth. Nitrate is important for calli differentiation and growth, and a high ammonium content increased somatic embryo frequency. The embryogenic vs. undifferentiated cell growth commitment of flax explants was determined by interaction between calcium and ZEA levels, a high calcium/low ZEA affording very low embryogenic potential and high calli biomass. A high ZEA concentration was essential for the normal development of somatic embryos. Using a single medium hormonal variant for induction and development of somatic embryogenesis and shoot organogenesis from flax hypocotyls, a comparative study was performed, through analysis by GC and GC-MS, to determine the free sterols content and composition in non-morphogenic, shoot organogenic and embryogenic calli as well as in regenerated shoots and somatic embryos. The induction of somatic embryogenesis and shoot organogenesis of flax was associated with an increase of total sterols in the competent calli and an increased ratio of stigmasterol to β-sitosterol in derived embryos and shoots. On the contrary, in non-morphogenic calli, the ratio stigmasterol to β-sitosterol decreased during the exponential growth phase due to a drastic rise in the β-sitosterol content. This effect as well as the calli growth were higher with 0.5 mg/l 2,4-D than with 0.6 mg/l IBA. The content of total, neutral and acid fractions of lipidic extracts as well as the contents and composition of hydrocarbons, esterified and free fatty acids fractions, sampled at different developmental stages, were studied by GC and GC-MS. During induction and development of callus from hypocotyl tissues, a decrease in the percentage of total lipids was observed. In all types of tissue sampled - hypocotyl segments (SH) used as primary explants, SH with differentiating calli at the cut ends (SHC), embryogenic (CE) and non-embryogenic calli (CNE) and somatic embryos (ES) – a skewed-normal distribution of n-alkanes with a low mass range (C13-C21) was found. The highest content of n-alkanes occurred in the primary hypocotyl explant and in the early stages of callus development. Longer carbon chain n-alkanes were observed only in the mature or differentiated tissues of hypocotyls and ES. Although the n-alkane contents decreased with time, in ES and calli, a significant lower n-alkane content was observed in CE when compared to CNE independent of time in culture. These results suggest the utilisation of n-alkanes for heterotrophic cellular growth as well as its mobilisation from CE to developing ES. The statistical and multivariate analyses performed to analyse the bulk results obtained for the fatty acid fractions revealed that there was a high increment in the AG content (free and sterified) associated with the induction and development of calli from SH explants. Significant differences related to calli embriogenic capacity and growth phase and to the development of somatic embryos in culture were also found. Various groups of fatty acids, namely, polyunsaturated fatty acids, very long chain and medium chain fatty acids were responsible for those differences. Different cultures have shown distinct AG compositions. The variation pattern presented by 18:3/18:2 and 18:0/18:3 suggest a role for these ratios as markers of ES photoautotrophy and calli growth phase and of calli embryogenic capacity, respectively. 1. Murashige T. e Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497.
Tipo de Documento
Tese de Doutoramento
Idioma Português
Orientador(es) Ferreira, Manuel Fernandes
Idioma Português
Orientador(es) Ferreira, Manuel Fernandes
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