Author(s):
Lopes, Paula 
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10348/65
Origin: Repositório da UTAD
Subject(s): Genética; Método de Melhoramento; Marcadores genéticos; Trigo
Document details
Estudos moleculares da genética da tolerância ao alumínio em trigos
Description
O melhoramento genético do trigo (Triticum aestivum L.), em relação à tolerância ao alumínio, é uma das soluções mais económicas para o aumento da produtividade desta cultura em solos ácidos. As fontes desta tolerância a este stress abiótico são limitadas no germoplasma domesticado, tornando a identificação e caracterização de novas fontes uma prioridade para o futuro do melhoramento de plantas em áreas com problemas de toxicidade como as que ocorrem em Portugal. Uma colecção de trigos antigos moles portugueses foi testada e classificada em relação ao seu comportamento à tolerância ao alumínio usando uma cultura hidropónica, apresentadose os resultados no Capítulo 3. Três cultivares (‘Viloso Mole’, Magueija’ and ‘Ruivo’) demonstraram ter maior tolerância a 5 p.p.m. de alumínio do que a testemunha de trigo tolerante usada internacionalmente, ‘BH1146’, e daí serem consideradas um excelente material para estudos de controlo genético da tolerância ao alumínio. Adicionalmente, várias linhas de ‘Barbela’, uma antiga “landrace” portuguesa, apresentaram valores notáveis de tolerância, tendo a linha 7/72/92 obtido um acréscimo de recrescimento das raízes significativo em relação à testemunha ‘BH1146’. Neste contexto, foram efectuados cruzamentos entre duas linhas de ‘Barbela’ que tinham um comportamento diferencial em relação ao stress ao alumínio (a linha 5/21 que é mais sensível à toxicidade do Al e a linha 61/94 que é mais tolerante), cujos resultados são apresentados no Capítulo 4. A polinização dos híbridos F1 (do cruzamento destas duas linhas de ‘Barbela’) com milho permitiu a obtenção de uma população descendente dupla haplóide, que foi classificada em solução nutritiva em relação à sua tolerância ao alumínio. Os padrões de segregação entre os duplos haplóides são consistentes com a presença de dois genes que diferem alelicamente entre as duas linhas progenitoras de ‘Barbela’. Com a finalidade de detectar marcadores moleculares associados à tolerância ao alumínio da linha 61/94, foram exploradas duas estratégias distintas: análise de segregação de grupos (BSA) e mapeamento individual. A estratégia BSA, usando marcadores de SSRs e AFLPs, não foi efectiva; mas o mapeamento individual permitiu definir cinco fragmentos de AFLP que estavam ligados à tolerância ao alumínio. Com o objectivo de comparar os resultados laboratoriais com o comportamento no campo, mas tendo em vista a dificuldade dos ensaios de campo, devido à heterogeneidade ambiental, foi utilizado um ensaio de vasos para avaliar a capacidade de crescimento de plântulas de trigo em solo com reacção ácida. Observou-se uma correlação significativa, entre os recrescimentos das raízes das plântulas em solução nutritiva e a produção de biomassa da parte aérea do ensaio de vasos (r = 0,656; P < 0,001). No Capítulo 5, é apresentado um mapa genético de ‘Barbela’, que consiste na combinação de marcadores de SSR e AFLP, utilizando uma população de retrocruzamento. O mapa consiste de 23 grupos de ligação e cobriu 1 449 cM, com uma distância média entre marcadores de 7,9 cM. A descendência dos indivíduos de retrocruzamento foi autofecundada e avaliadas em relação à sua resposta ao stress de alumínio em solução hidropónica. Combinando os dados fenotípicos com o mapa, foi possível associar oito QTLs à tolerância ao alumínio, sendo estes responsáveis por 58,8% da variação fenotípica. Seis destes QTLs provinham do progenitor ‘Chinese Spring’ e dois do ‘Barbela’. Estes últimos estavam localizados no braço curto do cromossoma 6A. O desenvolvimento de PCRs específicos a partir de bandas de AFLP clonadas apresenta dificuldades já referidas por vários autores, devido à complexidade dos fragmentos que comigram com o fragmento de interesse. No Capítulo 6, são descritas várias estratégias, que podem melhorar a eficiência do isolamento de fragmentos de AFLP alvo. As estratégias que foram as mais efectivas, eficientes e fidedignas foram as que envolveram a clonagem dos produtos de AFLP. Para reduzir o número de colónias que precisam de ser sequenciadas, foi desenvolvido um método baseado no SSCP, em que a selecção das colónias reduziu significativamente o número de sequenciações requeridas. Foram gerados “primers” em quatro dos cinco fragmentos de AFLP ligados à tolerância ao alumínio (obtidas no Capítulo 4), e foi possível converter um deles num marcador CAPS facilmente utilizável. Um vez que a expressão génica do stress ao alumínio está ainda pouco clarificada no trigo, quatro linhas de duplos haplóides seleccionadas, que diferiam marcadamente em termos da sua tolerância ao alumínio em solução hidropónica, foram analisadas com o seu cDNA, tendo sido simultaneamente analisadas quer com a presença quer com a ausência de stress ao alumínio (Capítulo 7). Foram clonados e sequenciados um total de 19 fragmentos com a finalidade de determinar a sua função. Foram desenvolvidos “primers” duma série de fragmentos (10) com o fim de aplicar em DNA genómico. Três combinações de “primers” produziram um polimorfismo associado com a tolerância ao alumínio. Identificaram-se vários genes candidatos para análises futuras. No Capítulo 8, foram testadas quatro combinações de “primers” desenvolvidos em centeio, nos duplos haplóides de trigo ‘Barbela’ e ainda, os marcadores de cDNA desenvolvidos no Capítulo 7. Relativamente aos quatro “primers” desenvolvidos em centeio, uma combinação de “primers” permitiu a diferenciação dos genótipos tolerantes e sensíveis nas linhas duplas haplóides de ‘Barbela’. Utilizando um grupo de cultivares antigas de trigo português, previamente classificadas como tolerantes e sensíveis, no Capítulo 3, com os marcadores de cDNA foi possível amplificar dois fragmentos presentes no ‘Barbela 61/94’ e noutros genótipos tolerantes de trigos, mas ausentes nos genótipos sensíveis. As sequências destes dois fragmentos estão relacionadas com os genes da Y-glucosidase e do pseudo regulador de resposta. No Capítulo 9 apresentam-se as conclusões gerais do trabalho desenvolvido. Os resultados apresentados indicam que a tolerância ao alumínio no trigo ‘Barbela’ envolve vários genes. Estes genes podem ser úteis para o melhoramento da tolerância ao alumínio nos programas de melhoramento de trigo, especialmente para as zonas de solos de reacção ácida em que a toxicidade ao alumínio é um factor limitante de produtividade. Os marcadores moleculares obtidos e/ou testados podem constituir uma ferramenta importante na aplicação da selecção assistida por marcadores em programas de melhoramento. Genetic improvement in aluminium tolerance is one of the most cost-effective solutions to improve the productivity of wheat (Triticum aestivum L.) in acidic soils. Sources of tolerance to this abiotic stress within adapted germplasm are limited, so the identification and characterisation of new sources are of some priority for the future of plant breeding in target areas, such as those that occur in Portugal An old collection of Portuguese bread wheat cultivars were tested and classified in relation to aluminium tolerance using a hydroponic approach, as presented in Chapter 3. Three entries (‘Viloso Mole’, Magueija’ and ‘Ruivo’) showed greater tolerance to 5ppm aluminium than the international wheat standard line ‘BH1146’, and so represent excellent material for understanding the genetic control of aluminium tolerance. In addition, several accessions of the Portuguese landrace ‘Barbela’ were outstanding in terms of aluminium tolerance. In particular, line 7/72/92 had a pronounced advantage over ‘BH1146’ in terms of root re-growth. In this context, crosses were made between two ‘Barbela’ lines which behaved differentially in relation to aluminium stress (line 5/21 is more sensitive to Al toxicity, while line 61/94 is tolerant), as presented in Chapter 4. Pollination of the F1 hybrid (from the crosses between this two ‘Barbela’ lines) with maize allowed the production of a family of doubled haploid progenies, which were classified by hydroponics in relation to their aluminium tolerance. Segregation patterns among the doubled haploids are consistent with the presence of two genes which differ allelically between the two parental ‘Barbela’ lines. In order to detect molecular markers linked to the aluminium tolerance of line 61/94, two different approaches, bulk segregant analysis (BSA) and individual mapping, were exploited. The BSA strategy, using microsatellite and AFLP markers, was ineffective, but via individual mapping, it was possible to define five AFLP fragments linked to tolerance. With the aim of comparing lab results with field behaviour, but having in attention that field experiments are difficult because of environmental heterogeneity, pot tests were used to evaluate the plant survival in effected soils. A significant correlation was observed between the root regrowth of seedlings in nutritive solution and the leaf biomass production in pot testing (r = 0,656; P < 0,001). In Chapter 5, a genetic map of ‘Barbela’ is reported, consisting of a combination of SSR and AFLP markers, using a backcross mapping population. The map consisted of 23 linkage groups, and covered 1,449 cM with an average distance between markers of 7.9 cM. The self-pollinated progenies of the backcross individuals were tested for response to aluminium stress by hydroponics. Combining this phenotypic data with the map, it was possible to link eight QTL to aluminium tolerance, and these accounted for 58.8% of the phenotypic variation. Six of the QTL were derived from the ‘Chinese Spring’ parent, and two from ‘Barbela’. The latter were located on short arm of chromosome 6A. Developing specific PCR assays from a cloned AFLP is a difficult process already described by other authors, due to the complexity of the amplicons comigrating with the target fragment. In Chapter 6, several strategies are described, which sought to improve the efficiency of isolating the target AFLP fragment. Approaches which involved cloning of AFLP products were the most effective, efficient and reliable. In order to reduce the number of clones requiring sequencing, a method based on SSCP was developed, in which colony selection allowed a significant reduction in sequencing requirement. Of the five AFLP fragments linked to aluminium tolerance (obtained in Chapter 4), primers could be generated to four, and it was possible to convert one of these into an easily usable CAPS marker. Since gene expression in response to aluminium stress is still poorly clarified in wheat, four selected double haploid lines, which differed markedly in terms of their aluminium tolerance in hydroponics, were analysed with cDNA, both in the presence and absence of aluminium stress (Chapter 7). A total of nineteen fragments were cloned and sequenced in order to determine their function. Several PCR assays were tested using some of the fragments (10), with the aim of applying them to genomic DNA. Three of this assays produced a polymorphism linked to aluminium tolerance. Several candidate genes were identified for future analysis. In Chapter 8, four PCR assays developed in rye against the doubled haploids and markers developed for cDNA, in Chapter 7 were tested. In relation to the four PCR assays developed in rye, one of these was able to differentiate between the tolerant and sensitive genotypes of ‘Barbela’ doubled haploid lines. A group of old Portuguese cultivars, previously classified as tolerant and sensitive in Chapter 3, were used to test the cDNA markers. It was possible to amplify two fragments present in both ‘Barbela 61/94’ and in other tolerant genotypes, but absent in sensitive genotypes. The sequences of these two fragments are related to Y- glycosidase and pseudo response regulator genes. In Chapter 9 the general conclusions of the work developed are presented. The results presented in this thesis indicate that aluminium tolerance in ‘Barbela’ wheat involves several genes. Those genes will be useful for the improvement of aluminium tolerance in wheat breeding programmes, especially in acid soil regions were aluminium toxicity is a limiting factor in productivity. The molecular markers obtained and/or tested may constitute an important tool in the application of marker assisted selection in plant breeding. Tese de Doutoramento em Genética, apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Fundação para a Ciência e Tecnologia, Subprograma Ciência e Tecnologia do 2º Quadro Comunitário de Apoio. (PRAXIS XXI/BD/15864/98)
O melhoramento genético do trigo (Triticum aestivum L.), em relação à tolerância ao alumínio, é uma das soluções mais económicas para o aumento da produtividade desta cultura em solos ácidos. As fontes desta tolerância a este stress abiótico são limitadas no germoplasma domesticado, tornando a identificação e caracterização de novas fontes uma prioridade para o futuro do melhoramento de plantas em áreas com problemas de toxicidade como as que ocorrem em Portugal. Uma colecção de trigos antigos moles portugueses foi testada e classificada em relação ao seu comportamento à tolerância ao alumínio usando uma cultura hidropónica, apresentadose os resultados no Capítulo 3. Três cultivares (‘Viloso Mole’, Magueija’ and ‘Ruivo’) demonstraram ter maior tolerância a 5 p.p.m. de alumínio do que a testemunha de trigo tolerante usada internacionalmente, ‘BH1146’, e daí serem consideradas um excelente material para estudos de controlo genético da tolerância ao alumínio. Adicionalmente, várias linhas de ‘Barbela’, uma antiga “landrace” portuguesa, apresentaram valores notáveis de tolerância, tendo a linha 7/72/92 obtido um acréscimo de recrescimento das raízes significativo em relação à testemunha ‘BH1146’. Neste contexto, foram efectuados cruzamentos entre duas linhas de ‘Barbela’ que tinham um comportamento diferencial em relação ao stress ao alumínio (a linha 5/21 que é mais sensível à toxicidade do Al e a linha 61/94 que é mais tolerante), cujos resultados são apresentados no Capítulo 4. A polinização dos híbridos F1 (do cruzamento destas duas linhas de ‘Barbela’) com milho permitiu a obtenção de uma população descendente dupla haplóide, que foi classificada em solução nutritiva em relação à sua tolerância ao alumínio. Os padrões de segregação entre os duplos haplóides são consistentes com a presença de dois genes que diferem alelicamente entre as duas linhas progenitoras de ‘Barbela’. Com a finalidade de detectar marcadores moleculares associados à tolerância ao alumínio da linha 61/94, foram exploradas duas estratégias distintas: análise de segregação de grupos (BSA) e mapeamento individual. A estratégia BSA, usando marcadores de SSRs e AFLPs, não foi efectiva; mas o mapeamento individual permitiu definir cinco fragmentos de AFLP que estavam ligados à tolerância ao alumínio. Com o objectivo de comparar os resultados laboratoriais com o comportamento no campo, mas tendo em vista a dificuldade dos ensaios de campo, devido à heterogeneidade ambiental, foi utilizado um ensaio de vasos para avaliar a capacidade de crescimento de plântulas de trigo em solo com reacção ácida. Observou-se uma correlação significativa, entre os recrescimentos das raízes das plântulas em solução nutritiva e a produção de biomassa da parte aérea do ensaio de vasos (r = 0,656; P < 0,001). No Capítulo 5, é apresentado um mapa genético de ‘Barbela’, que consiste na combinação de marcadores de SSR e AFLP, utilizando uma população de retrocruzamento. O mapa consiste de 23 grupos de ligação e cobriu 1 449 cM, com uma distância média entre marcadores de 7,9 cM. A descendência dos indivíduos de retrocruzamento foi autofecundada e avaliadas em relação à sua resposta ao stress de alumínio em solução hidropónica. Combinando os dados fenotípicos com o mapa, foi possível associar oito QTLs à tolerância ao alumínio, sendo estes responsáveis por 58,8% da variação fenotípica. Seis destes QTLs provinham do progenitor ‘Chinese Spring’ e dois do ‘Barbela’. Estes últimos estavam localizados no braço curto do cromossoma 6A. O desenvolvimento de PCRs específicos a partir de bandas de AFLP clonadas apresenta dificuldades já referidas por vários autores, devido à complexidade dos fragmentos que comigram com o fragmento de interesse. No Capítulo 6, são descritas várias estratégias, que podem melhorar a eficiência do isolamento de fragmentos de AFLP alvo. As estratégias que foram as mais efectivas, eficientes e fidedignas foram as que envolveram a clonagem dos produtos de AFLP. Para reduzir o número de colónias que precisam de ser sequenciadas, foi desenvolvido um método baseado no SSCP, em que a selecção das colónias reduziu significativamente o número de sequenciações requeridas. Foram gerados “primers” em quatro dos cinco fragmentos de AFLP ligados à tolerância ao alumínio (obtidas no Capítulo 4), e foi possível converter um deles num marcador CAPS facilmente utilizável. Um vez que a expressão génica do stress ao alumínio está ainda pouco clarificada no trigo, quatro linhas de duplos haplóides seleccionadas, que diferiam marcadamente em termos da sua tolerância ao alumínio em solução hidropónica, foram analisadas com o seu cDNA, tendo sido simultaneamente analisadas quer com a presença quer com a ausência de stress ao alumínio (Capítulo 7). Foram clonados e sequenciados um total de 19 fragmentos com a finalidade de determinar a sua função. Foram desenvolvidos “primers” duma série de fragmentos (10) com o fim de aplicar em DNA genómico. Três combinações de “primers” produziram um polimorfismo associado com a tolerância ao alumínio. Identificaram-se vários genes candidatos para análises futuras. No Capítulo 8, foram testadas quatro combinações de “primers” desenvolvidos em centeio, nos duplos haplóides de trigo ‘Barbela’ e ainda, os marcadores de cDNA desenvolvidos no Capítulo 7. Relativamente aos quatro “primers” desenvolvidos em centeio, uma combinação de “primers” permitiu a diferenciação dos genótipos tolerantes e sensíveis nas linhas duplas haplóides de ‘Barbela’. Utilizando um grupo de cultivares antigas de trigo português, previamente classificadas como tolerantes e sensíveis, no Capítulo 3, com os marcadores de cDNA foi possível amplificar dois fragmentos presentes no ‘Barbela 61/94’ e noutros genótipos tolerantes de trigos, mas ausentes nos genótipos sensíveis. As sequências destes dois fragmentos estão relacionadas com os genes da Y-glucosidase e do pseudo regulador de resposta. No Capítulo 9 apresentam-se as conclusões gerais do trabalho desenvolvido. Os resultados apresentados indicam que a tolerância ao alumínio no trigo ‘Barbela’ envolve vários genes. Estes genes podem ser úteis para o melhoramento da tolerância ao alumínio nos programas de melhoramento de trigo, especialmente para as zonas de solos de reacção ácida em que a toxicidade ao alumínio é um factor limitante de produtividade. Os marcadores moleculares obtidos e/ou testados podem constituir uma ferramenta importante na aplicação da selecção assistida por marcadores em programas de melhoramento. Genetic improvement in aluminium tolerance is one of the most cost-effective solutions to improve the productivity of wheat (Triticum aestivum L.) in acidic soils. Sources of tolerance to this abiotic stress within adapted germplasm are limited, so the identification and characterisation of new sources are of some priority for the future of plant breeding in target areas, such as those that occur in Portugal An old collection of Portuguese bread wheat cultivars were tested and classified in relation to aluminium tolerance using a hydroponic approach, as presented in Chapter 3. Three entries (‘Viloso Mole’, Magueija’ and ‘Ruivo’) showed greater tolerance to 5ppm aluminium than the international wheat standard line ‘BH1146’, and so represent excellent material for understanding the genetic control of aluminium tolerance. In addition, several accessions of the Portuguese landrace ‘Barbela’ were outstanding in terms of aluminium tolerance. In particular, line 7/72/92 had a pronounced advantage over ‘BH1146’ in terms of root re-growth. In this context, crosses were made between two ‘Barbela’ lines which behaved differentially in relation to aluminium stress (line 5/21 is more sensitive to Al toxicity, while line 61/94 is tolerant), as presented in Chapter 4. Pollination of the F1 hybrid (from the crosses between this two ‘Barbela’ lines) with maize allowed the production of a family of doubled haploid progenies, which were classified by hydroponics in relation to their aluminium tolerance. Segregation patterns among the doubled haploids are consistent with the presence of two genes which differ allelically between the two parental ‘Barbela’ lines. In order to detect molecular markers linked to the aluminium tolerance of line 61/94, two different approaches, bulk segregant analysis (BSA) and individual mapping, were exploited. The BSA strategy, using microsatellite and AFLP markers, was ineffective, but via individual mapping, it was possible to define five AFLP fragments linked to tolerance. With the aim of comparing lab results with field behaviour, but having in attention that field experiments are difficult because of environmental heterogeneity, pot tests were used to evaluate the plant survival in effected soils. A significant correlation was observed between the root regrowth of seedlings in nutritive solution and the leaf biomass production in pot testing (r = 0,656; P < 0,001). In Chapter 5, a genetic map of ‘Barbela’ is reported, consisting of a combination of SSR and AFLP markers, using a backcross mapping population. The map consisted of 23 linkage groups, and covered 1,449 cM with an average distance between markers of 7.9 cM. The self-pollinated progenies of the backcross individuals were tested for response to aluminium stress by hydroponics. Combining this phenotypic data with the map, it was possible to link eight QTL to aluminium tolerance, and these accounted for 58.8% of the phenotypic variation. Six of the QTL were derived from the ‘Chinese Spring’ parent, and two from ‘Barbela’. The latter were located on short arm of chromosome 6A. Developing specific PCR assays from a cloned AFLP is a difficult process already described by other authors, due to the complexity of the amplicons comigrating with the target fragment. In Chapter 6, several strategies are described, which sought to improve the efficiency of isolating the target AFLP fragment. Approaches which involved cloning of AFLP products were the most effective, efficient and reliable. In order to reduce the number of clones requiring sequencing, a method based on SSCP was developed, in which colony selection allowed a significant reduction in sequencing requirement. Of the five AFLP fragments linked to aluminium tolerance (obtained in Chapter 4), primers could be generated to four, and it was possible to convert one of these into an easily usable CAPS marker. Since gene expression in response to aluminium stress is still poorly clarified in wheat, four selected double haploid lines, which differed markedly in terms of their aluminium tolerance in hydroponics, were analysed with cDNA, both in the presence and absence of aluminium stress (Chapter 7). A total of nineteen fragments were cloned and sequenced in order to determine their function. Several PCR assays were tested using some of the fragments (10), with the aim of applying them to genomic DNA. Three of this assays produced a polymorphism linked to aluminium tolerance. Several candidate genes were identified for future analysis. In Chapter 8, four PCR assays developed in rye against the doubled haploids and markers developed for cDNA, in Chapter 7 were tested. In relation to the four PCR assays developed in rye, one of these was able to differentiate between the tolerant and sensitive genotypes of ‘Barbela’ doubled haploid lines. A group of old Portuguese cultivars, previously classified as tolerant and sensitive in Chapter 3, were used to test the cDNA markers. It was possible to amplify two fragments present in both ‘Barbela 61/94’ and in other tolerant genotypes, but absent in sensitive genotypes. The sequences of these two fragments are related to Y- glycosidase and pseudo response regulator genes. In Chapter 9 the general conclusions of the work developed are presented. The results presented in this thesis indicate that aluminium tolerance in ‘Barbela’ wheat involves several genes. Those genes will be useful for the improvement of aluminium tolerance in wheat breeding programmes, especially in acid soil regions were aluminium toxicity is a limiting factor in productivity. The molecular markers obtained and/or tested may constitute an important tool in the application of marker assisted selection in plant breeding. Tese de Doutoramento em Genética, apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Fundação para a Ciência e Tecnologia, Subprograma Ciência e Tecnologia do 2º Quadro Comunitário de Apoio. (PRAXIS XXI/BD/15864/98)
Document Type
Doctoral Thesis
Language Portuguese
Advisor(s) Guedes-Pinto, Henrique; Koebner, Robert
Language Portuguese
Advisor(s) Guedes-Pinto, Henrique; Koebner, Robert
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