Autor(es):
Marques, Carolina Almeida 
Data: 2010
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10348/561
Origem: Repositório da UTAD
Detalhes do Documento
Study the response to acetate in colorectal carcinoma cells harbouring differen...
Descrição
O carcinoma colorectal é o terceiro tipo de cancro mais comum no mundo, estimando-se que existam mais de um milhão de novos casos por ano e aproximadamente metade dos casos resultam em morte, sendo uma das causas mais comuns de morte por cancro no mundo. Neste contexto, torna-se importante a descoberta de novas abordagens terapêuticas para este tipo de carcinomas. Existem dois oncogenes principais implicados no desenvolvimento do cancro colorectal esporádico, sendo as mutações KRAS e BRAF mutuamente exclusivas, ocorrendo em 30% e 10% dos casos de carcinoma colorectal, respectivamente.O uso da propionibacteria, proveniente da dieta alimentar, como probiótico pode vir a tornar-se uma estratégia útil no combate ao carcinoma colorectal. Estas bactérias produzem ácidos gordos de cadeia curta no intestino, nomeadamente propionato e acetato. Este último parece induzir a morte por apoptose em células do carcinoma colorectal mas não em células normais.Os lisossomas estão implicados em vias da morte celular, uma vez que a permeabilização da membrana lisossomal e a libertação de enzimas lisossomais, como as catepsinas, para o citoplasma pode induzir apoptose. O tratamento com ácido acético em S. cerevisiae induz morte celular através da degradação da mitocôndria e o Pep4p, o ortólogo da catepsina D humana nas leveduras, é libertado do vacúolo para o citoplasma.A ceramida e os esfingolípidos relacionados têm um papel conservado evolutivamente na resposta celular ao stress, regulando o crescimento celular, a diferenciação, senescência e sobrevivência. A ceramida desempenha um papel importante no cancro, sendo capaz de induzir apoptose em células tumorais, incluindo células do carcinoma colorectal. A ceramida e o seu metabolismo podem também ter um papel importante na indução da permeabilização da membrana do lisossoma, já que a ceramida gerada pela esfingomielinase ácida endolisosomal liga-se e activa a catepsina D. O envolvimento da ceramida e da permeabilização da membrana do lisossoma na morte celular induzida pelo acetato em células do carcinoma colorectal com diferente activação oncogénica, tanto quanto temos conhecimento, nunca foi investigada.No presente estudo, o nosso objectivo era o de estudar a diferente sensibilidade ao acetato em células do carcinoma colorectal com mutações nos ongenes KRAS e BRAF e elucidar o envolvimento da permeabilização da membrana do lisossoma e da ceramida na morte celular induzida pelo acetato nestas células. Para esse fim, usámos duas linhas celulares derivadas de carcinoma colorectal: HCT-15, com a mutação KRASG13D, e RKO com a mutação a BRAFV600E. As linhas celulares foram tratadas com diferentes concentrações de acetato de sódio e foram realizados estudos sobre a viabilidade celular, proliferação celular e apoptose. Também foi analisada a indução da permeabilização da membrana do lisossoma e o papel da ceramida. Os nossos resultados confirmam que o acetato induz apoptose e demonstram que as células da linha celular HCT-15 são mais sensíveis ao acetato uma vez que o CI50 determinado para a linha celular RKO é quase o dobro do encontrado para a linha HCT-15, indicando que o background genético pode desempenhar um papel importante nesta resposta. Em ambas as linhas celulares, o acetato inibiu a proliferação celular e induziu a apoptose. Os nossos resultados demonstram ainda que a catepsina D parece ser libertada para o citoplasma em resposta ao acetato, ao contrário do que acontece às células não tratadas (controlo), sugerindo o envolvimento da permeabilização da membrana do lisossoma na apoptose induzida pelo acetato em células do carcinoma colorectal. Os nossos resultados sobre o papel da ceramida na apoptose induzida pelo acetato através da permeabilização da membrana do lisossoma carecem de mais investigação. Em resumo, os nossos resultados mostram que as células com a mutação KRASG13D são mais sensíveis ao acetato do que aquelas com a mutação BRAFV600E e que a permeabilização da membrana do lisossoma parece ser o mecanismo envolvido na apoptose induzida pelo acetato no carcinoma colorectal. As células tumorais parecem ser mais sensíveis a agentes destabilizadores do lisossoma, proporcionado a possibilidade de explorar esta via para induzir selectivamente a apoptose em células do carcinoma colorectal. A compreensão dos mecanismos subjacentes à morte celular induzida pelo acetato, nomeadamente o envolvimento da ceramida e da permeabilização da membrana do lisossoma oferece a possibilidade de usar o acetato e outros indutores da permeabilização da membrana do lisossoma como agentes terapêuticos no tratamento do carcinoma colorectal, por si só ou associados com outros agentes convencionais. Colorectal carcinoma (CRC) is the third most common form of cancer in the world, with more than one million estimated new cases per year, from which roughly half resulted in death, being one of the most common causes of cancer death worldwide. In this context the finding of new therapeutic approaches is of prime importance for these types of carcinomas. Two major oncogenes are implicated in sporadic colorectal carcinogenesis, KRAS and BRAF mutations which are alternative and occur respectively, in 30% and 10% of CRC cases.The use of dietary propionibacteria as a probiotic might be a useful strategy in CRC therapy. This bacteria produces short-chain fatty acids in the human intestine, namely propionate and acetate. Acetate can induce apoptotic cell death in colorectal carcinoma cells and not in normal colorectal cells. Lysosomes have been implicated in cell death pathways, since selective lysosomal membrane permeabilization (LMP) and release of lysosomal enzymes, such as cathepsins to the cytosol may induce apoptosis. It has been proved that in acetic acid-treated S. cerevisiae cell death is induced through mitochondrial degradation and Pep4p, the yeast ortholog of human cathepsin D, is released from the vacuole into the cytosol.Ceramide and related sphingolipids play an evolutionarily conserved role in the cellular response to stress by regulating cell growth, differentiation, senescence, and survival. Ceramide plays a particularly role in cancer, being able to induce apoptosis in tumour cells, including human colorectal carcinoma cells. Ceramide and its metabolism may have an important role in LMP induction. It has been shown that ceramide generated by the endolysosomal acid sphingomyelinases binds and activates the lysosomal Cat D. The involvement of ceramide and LMP in the cell death induced by acetate in CRC cells harbouring different oncogene activation to the best of our knowledge was never investigated. In the present study, we aimed to study the different sensitivity to acetate in CRC cells harbouring mutations in KRAS and BRAF oncogenes and to elucidate the involvement of LMP and ceramide in acetate-induced cell death in these cells. For that purpose we used two CRC derived cell lines: HCT-15 cell line, with a KRASG13D mutation and RKO cell line with a BRAFV600E mutation. The cell lines were treated with sodium acetate at different concentrations and we performed studies on cell viability, cell proliferation and apoptosis. We also performed analysis of LMP induction and analysis of the role of ceramide. Our results confirmed that acetate induces apoptosis and showed that HCT-15 cells are more sensitive to acetate since the IC50 found for RKO cell line is almost double of the IC50 found for HCT-15 cell line, indicating that the genetic background might have an important role on this response. In both cell lines, acetate inhibited cell proliferation and induced apoptosis. Our results also show that cathepsin D seems to be released to the cytosol in response to acetate, in contrast with untreated cells, suggesting the involvement of LMP in acetate-induced apoptosis in CRC cells. Our results in the role of ceramide in acetate-induced apoptosis through LMP need further investigation. In summary, our results showed that CRC cells harbouring KRASG13D mutation are more sensitive to acetate than those harbouring BRAFV600E mutation and that LMP seems to be a mechanism of acetate-induced apoptosis in CRC. Tumour cells seem to be more sensitive to lysosome-destabilizing agents, prompting the possibility of exploiting this pathway to selectively induce apoptosis in CRC cells. Understanding the mechanisms underlying acetate-induced cell death, namely the involvement of ceramide and LMP, provide the possibility of using acetate and other LMP inducers, as therapeutic agents in CRC therapy, alone or in association with conventional therapy. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde FCT
O carcinoma colorectal é o terceiro tipo de cancro mais comum no mundo, estimando-se que existam mais de um milhão de novos casos por ano e aproximadamente metade dos casos resultam em morte, sendo uma das causas mais comuns de morte por cancro no mundo. Neste contexto, torna-se importante a descoberta de novas abordagens terapêuticas para este tipo de carcinomas. Existem dois oncogenes principais implicados no desenvolvimento do cancro colorectal esporádico, sendo as mutações KRAS e BRAF mutuamente exclusivas, ocorrendo em 30% e 10% dos casos de carcinoma colorectal, respectivamente.O uso da propionibacteria, proveniente da dieta alimentar, como probiótico pode vir a tornar-se uma estratégia útil no combate ao carcinoma colorectal. Estas bactérias produzem ácidos gordos de cadeia curta no intestino, nomeadamente propionato e acetato. Este último parece induzir a morte por apoptose em células do carcinoma colorectal mas não em células normais.Os lisossomas estão implicados em vias da morte celular, uma vez que a permeabilização da membrana lisossomal e a libertação de enzimas lisossomais, como as catepsinas, para o citoplasma pode induzir apoptose. O tratamento com ácido acético em S. cerevisiae induz morte celular através da degradação da mitocôndria e o Pep4p, o ortólogo da catepsina D humana nas leveduras, é libertado do vacúolo para o citoplasma.A ceramida e os esfingolípidos relacionados têm um papel conservado evolutivamente na resposta celular ao stress, regulando o crescimento celular, a diferenciação, senescência e sobrevivência. A ceramida desempenha um papel importante no cancro, sendo capaz de induzir apoptose em células tumorais, incluindo células do carcinoma colorectal. A ceramida e o seu metabolismo podem também ter um papel importante na indução da permeabilização da membrana do lisossoma, já que a ceramida gerada pela esfingomielinase ácida endolisosomal liga-se e activa a catepsina D. O envolvimento da ceramida e da permeabilização da membrana do lisossoma na morte celular induzida pelo acetato em células do carcinoma colorectal com diferente activação oncogénica, tanto quanto temos conhecimento, nunca foi investigada.No presente estudo, o nosso objectivo era o de estudar a diferente sensibilidade ao acetato em células do carcinoma colorectal com mutações nos ongenes KRAS e BRAF e elucidar o envolvimento da permeabilização da membrana do lisossoma e da ceramida na morte celular induzida pelo acetato nestas células. Para esse fim, usámos duas linhas celulares derivadas de carcinoma colorectal: HCT-15, com a mutação KRASG13D, e RKO com a mutação a BRAFV600E. As linhas celulares foram tratadas com diferentes concentrações de acetato de sódio e foram realizados estudos sobre a viabilidade celular, proliferação celular e apoptose. Também foi analisada a indução da permeabilização da membrana do lisossoma e o papel da ceramida. Os nossos resultados confirmam que o acetato induz apoptose e demonstram que as células da linha celular HCT-15 são mais sensíveis ao acetato uma vez que o CI50 determinado para a linha celular RKO é quase o dobro do encontrado para a linha HCT-15, indicando que o background genético pode desempenhar um papel importante nesta resposta. Em ambas as linhas celulares, o acetato inibiu a proliferação celular e induziu a apoptose. Os nossos resultados demonstram ainda que a catepsina D parece ser libertada para o citoplasma em resposta ao acetato, ao contrário do que acontece às células não tratadas (controlo), sugerindo o envolvimento da permeabilização da membrana do lisossoma na apoptose induzida pelo acetato em células do carcinoma colorectal. Os nossos resultados sobre o papel da ceramida na apoptose induzida pelo acetato através da permeabilização da membrana do lisossoma carecem de mais investigação. Em resumo, os nossos resultados mostram que as células com a mutação KRASG13D são mais sensíveis ao acetato do que aquelas com a mutação BRAFV600E e que a permeabilização da membrana do lisossoma parece ser o mecanismo envolvido na apoptose induzida pelo acetato no carcinoma colorectal. As células tumorais parecem ser mais sensíveis a agentes destabilizadores do lisossoma, proporcionado a possibilidade de explorar esta via para induzir selectivamente a apoptose em células do carcinoma colorectal. A compreensão dos mecanismos subjacentes à morte celular induzida pelo acetato, nomeadamente o envolvimento da ceramida e da permeabilização da membrana do lisossoma oferece a possibilidade de usar o acetato e outros indutores da permeabilização da membrana do lisossoma como agentes terapêuticos no tratamento do carcinoma colorectal, por si só ou associados com outros agentes convencionais. Colorectal carcinoma (CRC) is the third most common form of cancer in the world, with more than one million estimated new cases per year, from which roughly half resulted in death, being one of the most common causes of cancer death worldwide. In this context the finding of new therapeutic approaches is of prime importance for these types of carcinomas. Two major oncogenes are implicated in sporadic colorectal carcinogenesis, KRAS and BRAF mutations which are alternative and occur respectively, in 30% and 10% of CRC cases.The use of dietary propionibacteria as a probiotic might be a useful strategy in CRC therapy. This bacteria produces short-chain fatty acids in the human intestine, namely propionate and acetate. Acetate can induce apoptotic cell death in colorectal carcinoma cells and not in normal colorectal cells. Lysosomes have been implicated in cell death pathways, since selective lysosomal membrane permeabilization (LMP) and release of lysosomal enzymes, such as cathepsins to the cytosol may induce apoptosis. It has been proved that in acetic acid-treated S. cerevisiae cell death is induced through mitochondrial degradation and Pep4p, the yeast ortholog of human cathepsin D, is released from the vacuole into the cytosol.Ceramide and related sphingolipids play an evolutionarily conserved role in the cellular response to stress by regulating cell growth, differentiation, senescence, and survival. Ceramide plays a particularly role in cancer, being able to induce apoptosis in tumour cells, including human colorectal carcinoma cells. Ceramide and its metabolism may have an important role in LMP induction. It has been shown that ceramide generated by the endolysosomal acid sphingomyelinases binds and activates the lysosomal Cat D. The involvement of ceramide and LMP in the cell death induced by acetate in CRC cells harbouring different oncogene activation to the best of our knowledge was never investigated. In the present study, we aimed to study the different sensitivity to acetate in CRC cells harbouring mutations in KRAS and BRAF oncogenes and to elucidate the involvement of LMP and ceramide in acetate-induced cell death in these cells. For that purpose we used two CRC derived cell lines: HCT-15 cell line, with a KRASG13D mutation and RKO cell line with a BRAFV600E mutation. The cell lines were treated with sodium acetate at different concentrations and we performed studies on cell viability, cell proliferation and apoptosis. We also performed analysis of LMP induction and analysis of the role of ceramide. Our results confirmed that acetate induces apoptosis and showed that HCT-15 cells are more sensitive to acetate since the IC50 found for RKO cell line is almost double of the IC50 found for HCT-15 cell line, indicating that the genetic background might have an important role on this response. In both cell lines, acetate inhibited cell proliferation and induced apoptosis. Our results also show that cathepsin D seems to be released to the cytosol in response to acetate, in contrast with untreated cells, suggesting the involvement of LMP in acetate-induced apoptosis in CRC cells. Our results in the role of ceramide in acetate-induced apoptosis through LMP need further investigation. In summary, our results showed that CRC cells harbouring KRASG13D mutation are more sensitive to acetate than those harbouring BRAFV600E mutation and that LMP seems to be a mechanism of acetate-induced apoptosis in CRC. Tumour cells seem to be more sensitive to lysosome-destabilizing agents, prompting the possibility of exploiting this pathway to selectively induce apoptosis in CRC cells. Understanding the mechanisms underlying acetate-induced cell death, namely the involvement of ceramide and LMP, provide the possibility of using acetate and other LMP inducers, as therapeutic agents in CRC therapy, alone or in association with conventional therapy. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde FCT
Tipo de Documento
Dissertação de Mestrado
Idioma Português
Orientador(es) Preto, Ana; Coutinho, Olga
Idioma Português
Orientador(es) Preto, Ana; Coutinho, Olga
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