Author(s):
Costa, Luís Miguel Viana Maltez da 
Date: 2014
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10348/3134
Origin: Repositório da UTAD
Subject(s): Rato; Traumatismos da medula espinhal; Locomoção; Análise de dados; Fenómenos biomecânicos; Cinemática; Rolipram; 636.02.09(043); 616.7(043)
Description
A lesão da medula espinhal é uma condição extramente grave que acarreta
elevados custos socioeconómicos devido às limitações físicas e stresse psicológico que
lhe estão associados. Apesar de décadas de investigação e ensaios clínicos, a
recuperação funcional em pessoas que sofrem de lesão aguda ou crónica da medula
espinhal é ainda muito limitada.
A lesão secundária que sucede ao dano inicial na medula espinhal origina
localmente uma resposta regenerativa espontânea limitada, mas é também responsável
por eventos moleculares e celulares que originam um ambiente inibitório para a
regeneração axonal. Os fatores inibitórios associados à mielina que se acumulam no
local da lesão, exercem várias ações que contribuem para a incapacidade regenerativa
dos axónios maduros da medula espinhal. Estes componentes são responsáveis pelo
desencadear de uma cascata de processos intracelulares que resulta na contração dos
filamentos de actina e miosina no cone de crescimento levando ao seu colapso. Vários
estudos demonstraram que o aumento dos níveis de adenosina monofostato cíclico
(cAMP) pode reduzir este efeito inibitório e reforçar a capacidade dos neurónios da
medula espinhal de regenerar para além da lesão. Nestes estudos, a elevação do cAMP
produziu-se pela administração de seus análogos ou indiretamente pela inibição de
enzimas responsáveis pela sua degradação, levando à sua acumulação intracelular.
Nesta tese estudamos o efeito da administração contínua de rolipram, um
inibidor da fosfodiesterase 4, na recuperação funcional e na preservação da substância
branca da medula espinhal após a sua lesão experimental. Este agente foi administrado
isoladamente durante duas semanas após lesão contusiva moderada da medula espinhal
torácica em fêmeas adultas de ratos Wistar.
A avaliação funcional realizou-se usando a escala de classificação locomotora
BBB de 21 pontos, o teste de locomoção em barra estreita e a análise cinemática
tridimensional do movimento dos membros pélvicos em tapete rolante. A análise
estereológica das medulas espinhais lesionadas, realizada oito semanas após a lesão,
permitiu-nos estimar o volume e comprimento da lesão e a área de substância branca
preservada no epicentro da lesão.
Os nossos resultados mostraram que administração de rolipram após contusão
moderada da medula espinhal proporcionou um melhor desempenho motor nos ratos
lesionados durante todo o período de teste. A avaliação dinâmica do movimento do pé
durante a marcha realizada oito semanas após a lesão revelou uma diminuição
significativa da rotação externa durante todo ciclo de passada nos animais tratados com rolipram. A análise estereológica não revelou diferenças significativas no volume e
comprimento da lesão em animais tratados e não-tratados com rolipram. Em
contrapartida, a quantidade de substância branca preservada foi significativamente
maior no grupo tratado com rolipram. Estes resultados sugerem um potencial
terapêutico para o rolipram em situações agudas de lesão da medula espinhal.
Devido às limitações da escala locomotora BBB, desenvolvemos um protocolo
de análise computadorizada da marcha do rato que nos permitiu obter medições
contínuas e precisas de parâmetros cinemáticos.
Nesta tese fornecemos uma descrição detalhada deste protocolo e expomos de
que forma superáramos as várias limitações da avaliação cinemática, nomeadamente o
artefacto de deslizamento da pele, o efeito da velocidade de locomoção nos parâmetros
cinemáticos e as diferenças entre as abordagens cinemáticas bidimensionais e
tridimensionais.
Os resultados obtidos confirmam a fiabilidade da avaliação cinemática da
locomoção em tapete rolante, sempre que se minimizem as possíveis influências da
velocidade de marcha, do movimento da pele a nível do joelho e dos erros de paralaxe
nos parâmetros angulares obtidos durante a locomoção.
Velocidades elevadas de marcha no rato originam maior extensão das
articulações do membro pélvico e diminuição de parâmetros temporais como o tempo
de suporte e a duração da passada. Os investigadores devem estar cientes do potencial
efeito da velocidade de marcha nos parâmetros cinemáticos obtidos em modelos
animais de locomoção.
Demonstrámos que a análise cinemática tridimensional proporciona a obtenção
de valores exatos e precisos e permite determinar as rotações externas ou internas do pé.
Os nossos resultados mostraram que há um movimento considerável da pele do
membro pélvico que se propaga como artefacto na determinação da posição do joelho e
na análise cinemática do membro, diminuindo a fiabilidade dos dados obtidos por
marcação cutânea desta articulação. A estimativa computadorizada indireta da posição
do joelho reduz os efeitos deste artefacto e, por conseguinte, melhora a análise
biomecânica do membro pélvico durante a locomoção. Spinal cord injury (SCI) is a devastating condition affecting millions of people
all over the world with overwhelming socioeconomic costs associated with physical
disability and psychological stress. Unfortunately, despite decades of research and
clinical trials, functional recovery is still very limited in patients suffering from acute or
chronic spinal cord lesion.
The secondary progressive tissue damage that follows the initial injury leads to a
limited spontaneous regenerative response at the lesion site, but is also responsible for a
multitude of cellular and molecular events that originate an inhibitory environment to
axonal regeneration.
Myelin-associated inhibitory components that accumulate on the lesion site, due
to its very slow clearance, exert multiple inhibitory actions contributing to the inability
of mature spinal cord axons to regenerate after injury. These components are
responsible for triggering an intracellular cascade that results on contraction of myosin
actin filaments at the filopodia originating growth cone collapse. Several studies have
demonstrated that the elevation of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) can reduce
this inhibitory effect and enhance the ability of spinal cord neurons to extend their
damaged axons. In those studies, elevation of spinal cAMP was accomplished either by
cAMP analogues administration or indirectly by inhibiting the enzymes responsible for
its degradation leading to its intracellular accumulation.
In this thesis we studied the effect of continuous administration of rolipram, a
Phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor, on locomotor recovery and spinal white matter
sparing following experimental SCI. Rolipram was administered as a sole agent for two
weeks following moderate thoracic spinal cord contusion injury in Wistar adult female
rats. Functional assessment was performed using the 21-point Basso, Beattie, and
Bresnahan (BBB) locomotor rating scale, beam walk test and three-dimensional
kinematic evaluation of hindlimbs movement on treadmill locomotion.
Stereological analysis of injured spinal cords, performed eight weeks postinjury,
allowed us to estimate lesion volume, lesion length and area of spared white
matter at lesion epicentre.
Our results showed that administration of rolipram following acute spinal cord
contusion resulted in improved motor performance during the entire testing period.
Dynamic assessment of foot motion during treadmill walking revealed a significantly decreased external rotation during the entire step cycle after 8 weeks in rolipram-treated
animals. Stereological analysis revealed no significant differences in lesion volume and
length. By contrast, spared white matter was significantly higher in the group treated
with rolipram. These results suggest a therapeutic role for rolipram delivered alone
following acute SCI.
Due to the limitations and subjectivity of the BBB locomotor rating scale we
developed a computerized rat gait analysis protocol which allowed us to obtain and
process highly accurate continuous kinematic measurements. In this thesis we provide a
detailed description of this protocol and we expose how we did overcome several
limitations of kinematic evaluation, namely the skin slippage artifact, the effects of
speed on angular parameters and the differences between two-dimensional and threedimensional
kinematic approaches.
Concerning the kinematic evaluation of the rat´s hindlimbs, our results suggest
that reliable kinematic measurements can be obtained from the treadmill gait analysis in
rats, if the experimenter is able to minimize the potential influences of gait speed, skin
movement and parallax errors on the angular parameters obtained during rat
locomotion.
Increased walking velocities in the rat are associated with increased hindlimb
joints extension and decreased temporal parameters. Researchers should be aware of the
potential role of walking velocity differences in gait research models.
We demonstrated that maximal precision and accuracy of the kinematic values
are expected when the experimental protocol includes a three-dimensional motion
analysis methodology in order to determine the external or internal rotation of the foot.
Our results revealed the presence of a considerable skin movement artifact
which propagates to knee joint position and hindlimb kinematics decreasing data
reliability in the research of rat gait analysis. The indirect computerized estimation of
the knee position can largely reduce the effects of this artefact and therefore improve biomechanical analyses. Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
