Author(s):
Cardoso, Luísa 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10348/2165
Origin: Repositório da UTAD
Document details
Transformação e regeneração da Planta medicinal Catharanthus Roseus
Description
Catharanthus roseus (L.) G. Don, vulgarmente conhecida como pervinca de Madagáscar, é uma planta de elevado valor medicinal devido à acumulação nas folhas de alcalóides indólicos monoterpenoides com actividade anti-cancerígena e antihipertensiva. A importância farmacêutica destes metabolitos secundários e os seus baixos níveis na planta fizeram de C. roseus uma das plantas medicinais mais estudadas a nível bioquímico e molecular. No entanto, ainda não foi desenvolvido nenhum protocolo eficaz de transformação e regeneração que permita a obtenção de plantas transgénicas desta espécie, potenciando a investigação fundamental e permitindo o desenvolvimento de estratégias de melhoramento genético. Neste trabalho, pretendeu-se optimizar um protocolo eficaz de regeneração de C. roseus e desenvolver um protocolo associado de transformação mediado por Agrobacterium tumefaciens, de forma a criar uma ferramenta experimental reprodutível permitindo a obtenção de plantas transgénicas de C. roseus. Foi apurado um protocolo eficaz de regeneração de C. roseus por embriogénese somática, utilizando como explant inicial embriões maduros extraídos de sementes de C. roseus colocados em meio MS suplementado com TDZ 5 μM. Foi conseguida uma proliferação elevada dos embriões somáticos utilizando meio MS com BAP 4,44 mM, e conseguiu-se um enraizamento óptimo utilizando meio MS com concentração total de macronutrientes e suplementado com IBA 1,2 μM. Foi também conseguida uma elevada taxa de sobrevivência durante a aclimatização das plantas regeneradas. Para a obtenção de plantas transgénicas, foi iniciada a optimização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens utilizando fusões de um gene de uma peroxidase classe III de C. roseus com a proteína fluorescente vermelha (RFP), sob a regulação do promotor constitutivo 35S. Foi desenvolvido e apurado um protocolo de transformação de embriões maduros de C. roseus integrado no desenrolar do protocolo de regeneração optimizado. Este protocolo permitiu a obtenção de tecido caloso embriogénico com células transformadas, em que ocorreu a integração e expressão do transgene, comprovada pela detecção de fluorescência vermelha típica do repórter RFP. O protocolo de transformação continua a ser optimizado, no entanto provou-se que os embriões maduros de C. roseus são susceptíveis à infecção por A. tumefaciens e que por isso a obtenção de plantas transgénicas desta espécie deverá ser alcançada brevemente. Catharanthus roseus (L.) G. Don, known as the Madagascar periwinkle, is a very important medicinal plant, due to the accumulation in the leaves of terpenoid indole alkaloids with anticancer and antihypertensia activities. The high pharmaceutical value of these secondary metabolites allied to the low levels present in the plant, made of C. roseus one of the most studied medicinal plants both at the biochemical and molecular levels. In spite of this, no efficient protocol for transformation and regeneration yielding transgenic plants is available, this being a tool that would potentiate fundamental research of the species and enable the development of strategies of genetic improvement. The aim of this work was to optimize an efficient protocol for regeneration of C. roseus and to develop an associated protocol of transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens, enabling to create a reproducible experimental tool for the production of C. roseus transgenic plants. We established an efficient regeneration system of C. roseus through somatic embryogenesis, using as explant mature embryos cultured in MS medium supplemented with 5 μM TDZ. High proliferation of somatic embryos was achieved using MS medium supplemented with 4.44 mM BAP, and maximum rooting efficiency was observed in MS medium supplemented with 1.2 μM IBA. A high survival rate was attained during acclimation of regenerated plants. For the production of transgenic plants, we started the optimization of a transformation protocol mediated by Agrobacterium tumefaciens, using fusions of a C. roseus class III peroxidase gene with the red fluorescent protein (RFP), under the control of the 35S constitutive promoter. We developed and improved a transformation protocol of mature embryos of C. roseus integrated in the optimized regeneration protocol. This procedure enabled the production of embryogenic callus with transformed cells with expression of the transgene, as shown by the detection of the characteristic red fluorescence of the reporter RFP. The transformation protocol is still under optimization, but it was shown that C. roseus mature embryos are susceptible to A. tumefaciens infection and thus, the production of transgenic plants of this species should soon be possible. Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
Catharanthus roseus (L.) G. Don, vulgarmente conhecida como pervinca de Madagáscar, é uma planta de elevado valor medicinal devido à acumulação nas folhas de alcalóides indólicos monoterpenoides com actividade anti-cancerígena e antihipertensiva. A importância farmacêutica destes metabolitos secundários e os seus baixos níveis na planta fizeram de C. roseus uma das plantas medicinais mais estudadas a nível bioquímico e molecular. No entanto, ainda não foi desenvolvido nenhum protocolo eficaz de transformação e regeneração que permita a obtenção de plantas transgénicas desta espécie, potenciando a investigação fundamental e permitindo o desenvolvimento de estratégias de melhoramento genético. Neste trabalho, pretendeu-se optimizar um protocolo eficaz de regeneração de C. roseus e desenvolver um protocolo associado de transformação mediado por Agrobacterium tumefaciens, de forma a criar uma ferramenta experimental reprodutível permitindo a obtenção de plantas transgénicas de C. roseus. Foi apurado um protocolo eficaz de regeneração de C. roseus por embriogénese somática, utilizando como explant inicial embriões maduros extraídos de sementes de C. roseus colocados em meio MS suplementado com TDZ 5 μM. Foi conseguida uma proliferação elevada dos embriões somáticos utilizando meio MS com BAP 4,44 mM, e conseguiu-se um enraizamento óptimo utilizando meio MS com concentração total de macronutrientes e suplementado com IBA 1,2 μM. Foi também conseguida uma elevada taxa de sobrevivência durante a aclimatização das plantas regeneradas. Para a obtenção de plantas transgénicas, foi iniciada a optimização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens utilizando fusões de um gene de uma peroxidase classe III de C. roseus com a proteína fluorescente vermelha (RFP), sob a regulação do promotor constitutivo 35S. Foi desenvolvido e apurado um protocolo de transformação de embriões maduros de C. roseus integrado no desenrolar do protocolo de regeneração optimizado. Este protocolo permitiu a obtenção de tecido caloso embriogénico com células transformadas, em que ocorreu a integração e expressão do transgene, comprovada pela detecção de fluorescência vermelha típica do repórter RFP. O protocolo de transformação continua a ser optimizado, no entanto provou-se que os embriões maduros de C. roseus são susceptíveis à infecção por A. tumefaciens e que por isso a obtenção de plantas transgénicas desta espécie deverá ser alcançada brevemente. Catharanthus roseus (L.) G. Don, known as the Madagascar periwinkle, is a very important medicinal plant, due to the accumulation in the leaves of terpenoid indole alkaloids with anticancer and antihypertensia activities. The high pharmaceutical value of these secondary metabolites allied to the low levels present in the plant, made of C. roseus one of the most studied medicinal plants both at the biochemical and molecular levels. In spite of this, no efficient protocol for transformation and regeneration yielding transgenic plants is available, this being a tool that would potentiate fundamental research of the species and enable the development of strategies of genetic improvement. The aim of this work was to optimize an efficient protocol for regeneration of C. roseus and to develop an associated protocol of transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens, enabling to create a reproducible experimental tool for the production of C. roseus transgenic plants. We established an efficient regeneration system of C. roseus through somatic embryogenesis, using as explant mature embryos cultured in MS medium supplemented with 5 μM TDZ. High proliferation of somatic embryos was achieved using MS medium supplemented with 4.44 mM BAP, and maximum rooting efficiency was observed in MS medium supplemented with 1.2 μM IBA. A high survival rate was attained during acclimation of regenerated plants. For the production of transgenic plants, we started the optimization of a transformation protocol mediated by Agrobacterium tumefaciens, using fusions of a C. roseus class III peroxidase gene with the red fluorescent protein (RFP), under the control of the 35S constitutive promoter. We developed and improved a transformation protocol of mature embryos of C. roseus integrated in the optimized regeneration protocol. This procedure enabled the production of embryogenic callus with transformed cells with expression of the transgene, as shown by the detection of the characteristic red fluorescence of the reporter RFP. The transformation protocol is still under optimization, but it was shown that C. roseus mature embryos are susceptible to A. tumefaciens infection and thus, the production of transgenic plants of this species should soon be possible. Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
Document Type
Master Thesis
Language Portuguese
Advisor(s) Leal, Fernanda; Sottomayor, Mariana
Language Portuguese
Advisor(s) Leal, Fernanda; Sottomayor, Mariana
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