Author(s):
Barreto, Ângela Maria Almeida 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10348/2155
Origin: Repositório da UTAD
Subject(s): Escherichia coli; Antibióticos; Resistência; Genómica; Crianças; Classificação filogenética; 579(043); 575(043)
Description
O desenvolvimento de resistências aos antibióticos, por estirpes bacterianas, tem-se revelado um problema crescente em saúde pública. Este fenómeno adquire, ainda, maiores proporções quando estirpes potencialmente patogénicas adquirem resistência à maioria dos antibióticos usados rotineiramente em clínica conduzindo a falha terapêutica e agravamento do estado de saúde do indivíduo.
Escherichia coli é uma bactéria gastrointestinal do Homem e da maioria dos animais usada como indicadora do grau de resistência a antibióticos neste ecossistema. Este facto, permite não só conhecer o nível de resistências em bactérias comensais como prever os níveis de resistências a antibióticos que poderão ocorrer em bactérias potencialmente patogénicas.
No âmbito de uma cooperação entre a Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro e o Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro, desenvolveu-se este trabalho que teve como objectivo o estudo genómico da resistência a antibióticos em estirpes de Escherichia coli de crianças saudáveis.
Um dos objectivos específicos do presente estudo foi a pesquisa de estirpes de E.coli produtoras de β-lactamases de amplo espectro (BLAE´s), utilizando-se meios de cultura suplementados com cefotaxima. De 118 amostras fecais analisadas, foram detectadas E. coli portadoras de BLAE´s em três crianças, pertencentes aos genes blaCTX-M-1, blaTEM-52 e blaSHV-12. Todos estes isolados (2 isolados/amostra fecal) foram testados para estudo da resistência a antibióticos (ácido nalidíxico, ciprofloxacina, estreptomicina, gentamicina, amicacina, tobramicina, tetraciclina, cloranfenicol, a combinação trimetoprim-sulfametoxazol, ampicilina, amoxicilina-ácido clavulânico, ceftazidima, cefotaxima, cefoxitina, imipenemo e aztreonam). Todos os isolados manifestaram resistência à ampicilina, quatro ao cloranfenicol, trimetoprimsulfametoxazol e à tetraciclina, tendo-se observado uma grande variedade de genes de resistência (cmlA, tetA, aadA, sul1, sul2 and sul3). Num isolado resistente ao ácido nalíxico e à ciprofloxacina foram detectadas duas mutações no gene gyrA (S83L+D87N) e uma no gene parC (S80I). Relativamente às sequências de inserção e entornos genéticos, encontrou-se a região de leitura aberta orf477 a ladear os genes blaCTX-M dos dois isolados BLAE´s mas não se amplificou a sequência de inserção ISEcp1 anterior ao gene. Quanto à classificação filogenética destes isolados, mediante a presença/ausência dos genes chuA, yjaA e tspE4.C2, obtiveram-se isolados pertencentes ao grupo filogenético A (2 isolados), 2 pertencentes ao B1 (ambos os grupos tipicamente comensais) e 2 ao D (potencialmente patogénico).
Um outro objectivo deste trabalho implicou o estudo dos fenótipos e genótipos de resistência a antibióticos (ácido nalidíxico, ciprofloxacina, estreptomicina, gentamicina, amicacina, tobramicina, tetraciclina, cloranfenicol, a combinação trimetoprimsulfametoxazol, ampicilina, amoxicilina-ácido clavulânico, ceftazidima, cefotaxima, cefoxitina, imipenemo e aztreonam) em estirpes de E. coli isoladas de amostras fecais de crianças saudáveis, a partir de meios de cultura sem suplemento de antibiótico. Com esta finalidade foram isoladas e estudadas 92 colónias de E. coli de 118 amostras fecais de crianças saudáveis (78%), em Portugal. Uma grande parte dos isolados manifestou resistência à ampicilina (40%), seguindo-se a estreptomicina (26%) e a tetraciclina (25%). O gene tetB, responsável pela resistência à tetraciclina, aadA, que codifica resistência à estreptomicina, sul1, sul2 e sul3, responsáveis pela resistência ao trimetoprim-sulfametoxazol e blaTEM que codifica resistência à ampicilina foram os mais detectados. Quanto à classificação filogenética, obtiveram-se 38 (69%) isolados pertencentes ao grupo filogenético B2, oito (15%) pertencentes ao D (ambos os grupos potencialmente patogénicos), cinco (9%) ao B1 e quatro (7%) ao A (tipicamente comensais).
Outro objectivo deste estudo foi a detecção de integrões, respectivas regiões variáveis, entornos genéticos e sequências de inserção. O integrão 1 foi encontrado em 12 (86%) dos 14 isolados resistentes ao trimetoprim-sulfametoxazol. Os genes qacEΔ1+sul1 foram detectados em dez (83%) dos 12 isolados que continham o integrão 1. A região variável do integrão 1, foi exibida em sete (70%) dos dez isolados que apresentaram qacEΔ1+sul1. Relativamente ao integrão 2, foi detectado em um isolado que continha o integrão de classe 1, tendo também sido encontrada a respectiva região variável. Na maioria dos isolados (75%) encontramos o gene blaTEM associado ao integrão 1. Nas regiões variáveis dos integrões foram encontrados diversos genes cassete implicados nas resistências bacterianas aos aminoglicósidos e ao trimetoprim.
Esta é a primeira vez que se detecta estirpes de E. coli produtoras de β-lactamases de amplo espectro (BLAE´s) de amostras fecais de crianças saudáveis, em Portugal. Por outro lado, observaram-se elevadas percentagens de resistências a antibióticos em estirpes de E. coli isoladas a partir de meios de cultura sem suplemento de antibiótico.
É de referir a importância de continuar com estudos de vigilância da resistência a antibióticos, com o objectivo de avaliar a sua evolução no tempo e determinar os factores que influenciam a sua selecção e disseminação. The rapid emerge and diffusion of antibiotic resistant microorganisms, established a public health problem worldwide. The selective pressure mediate by intensive use of antibiotics and the several bacteria mechanisms of genetic transfers, contributed to this situation.
Escherichia coli is a common inhabitant of the human and animal gut and is considered as an important “indicator bacteria” that could be used to track the evolution of antibiotic resistance in different ecosystems.
One hundred eighteen faecal samples (two isolates per sample) of healthy children were recovered in Portugal during October 2007 and February 2008 and were analyzed for extended-spectrum β-lactamases Escherichia coli (ESBL). CTX resistant E. coli isolates were recovered in 3 of 118 children samples and belonged to the blaCTX-M-1, blaTEM-52 and blaSHV-12 β-lactamase genes. All the isolates showed resistance to ampicillin and four to chloramphenicol, trimethoprim-sulfamethoxazole and tetracycline. A variety of resistance genes (cmlA, tetA, aadA, sul1, sul2 and sul3) was observed among our ESBL-producing E. coli isolates. Two amino acid changes in GyrA (S83L+D87N) and one in ParC (S80I) were identified in the nalidixic acid and ciprofloxacin-resistant isolate. The isolates corresponded to phylogroup A (2 isolates), B1 (2 isolates) and D (2 isolates). In relation to the genetic environments studied it was founded orf477 open reading region of that flank blaCTX-M genes of the two ESBL's isolates, but the sequence of insertion ISEcp1 was not amplified.
Faecal samples of healthy children were seeded, additionally, on Levine plates and 92 Escherichia coli isolates were recovered. The susceptibility to 16 antimicrobial agents was tested in these isolates; 40% of them showed resistance to ampicillin, 25% to tetracycline and 26% to streptomycin. The tetB gene, responsible for tetracycline resistance; aadA, which encodes resistance to streptomycin; sul1, sul2 and sul3 responsible for trimethoprim-sulfamethoxazole resistance and blaTEM which encodes resistance to ampicillin were the most detected ones. The majority of the isolates belonged to phylogroup B2 (69%). It what concerns to integrons detection, their variable regions, Relatively to detection of integrons, their variable regions, genetic environments and insertion sequences, the integron 1 was found in 12 (86%) of 14 isolates trimethoprim-sulfamethoxazole resistant isolates. qacEΔ1+sul1 genes were detected in 10 (83%) of 12 isolates containing the integron 1. The integron 1 variable region was shown in seven (70%) of the ten isolates that harboured qacEΔ1+sul1 genes. One isolate contained the combination of integron 1 and 2 and also the variable region the last one. In more than half (75%) of the isolates, the gene blaTEM was associated with the integron 1. In the integrons variable regions it was founded a diversity of cassette genes encoding aminoglycosides as well trimethoprim resistance.
This is the first time that is detected extended-spectrum β-lactamases Escherichia coli (ESBL) isolates from healthy children, in Portugal. Moreover, this study reveals high percentages of antibiotic resistance in isolates from agar plates without antibiotic supplementation.
It is important to refer the continuing of surveillance studies in antibiotic resistance to assess its evolution in time and determine the factors influencing the selection and dissemination of genetic determinants. Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
