Author(s):
Carvalho, Joana Cristina Reino, 1990- 
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9911
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biologia do desenvolvimento; Transcrição genética; Apoptose; Teses de mestrado - 2013
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 In vertebrates, the anteroposterior (AP) growth and patterning of the limb bud rely on an intricate regulatory genetic network involving Shh and Gli3. Although the mechanism allowing Shh to modulate Gli3 activity is well documented, the role of Msx genes, which constitute a small family of genes encoding homeodomain transcription factors that have been implicated in AP limb patterning, within this genetic network remains poorly understood. Based on empirical evidence generated by previous studies, we hypothesized that Msx genes may interact with the transcription factor Gli3, particularly, with its repressor form, Gli3R in order to drive limb morphogenesis. To test this hypothesis, we performed a series of protein interaction assays using the Proximity Ligation Assay (PLA) technique followed by quantification analysis. Using this technique we were able to produce evidence supporting our initial assumption admitting the in vivo interaction between the transcription factors Msx1 and Gli3R in the forelimb and hindlimb bud at 11.5 dpc. In parallel, we also investigated the involvement of these transcription factors in the BMP signaling pathway, by testing their ability to interact with the PSmad1,5,8 protein complex, the intracellular transducer of the BMP signaling cascade. Using the same experimental approach, we were able to demonstrate that both Msx1 and Gli3R interact with this protein complex in mesenchymal cells of the forelimb at 11.5 dpc. Based on these results and on the fact that the BMP signaling pathway has been systematically implicated in the apoptotic events taking place in the limb, together with the observation that the absence of Msx genes and/or Gli3 result in phenotypes concomitant with apoptosis impairment, we propose that Msx1, Gli3R and the Psmad1,5,8 proteins interact with each other in order to form a trimeric nuclear transcriptional complex that will drive the expression of BMP target genes involved in cell death regulation. Nos vertebrados, o crescimento e padronização anterior-posterior (AP) do botão do membro é regulado através de uma rede genética altamente complexa, cujos principais intervenientes incluem o fator parácrino Sonic hedgehog (Shh) e o fator de transcrição Gli3. A nível molecular, o principal papel do fator parácrino Shh durante o desenvolvimento do membro é contrabalançar a atividade do fator de transcrição Gli3, impedindo a formação de Gli3R, a forma truncada da proteína Gli3 que atua como um potente repressor transcricional que se acumula principalmente nas células da região anterior do botão do membro que não expressam Shh (Wang et al., 2000). Estas interações genéticas resultam na pré-padronização do botão do membro, definindo claramente duas regiões distintas: a região anterior, onde as células expressam altos níveis de Gli3R e baixos de Gli3A, e a região posterior que, uma vez que se encontra na proximidade da Zona de Atividade Polarizante (ZPA), o local de síntese do fator Shh, possui contrariamente à região anterior elevados níveis de Gli3A e baixos de Gli3R (Wang et al., 2000; Zeller et al., 2009). Apesar do mecanismo envolvido na regulação da atividade do fator Gli3 através da sinalização Shh estar bem documentado na literatura, o papel dos genes Msx, que constituem uma pequena família de fatores de transcrição envolvidos na morfogénese e padronização AP do botão do membro, no âmbito desta rede genética ainda não é bem conhecido. Diversos estudos têm sugerido que os genes Msx desempenham um papel fundamental na morfogénese do membro, interagindo com o fator de transcrição Gli3, mais especificamente com a sua forma repressora Gli3R. A prova mais direta que aponta para a existência de uma interação entre estes dois genes foi obtida no laboratório a partir de uma experiência de co-imunoprecipitação (Co-IP) realizada num sistema in vitro constituído por células HEK293 que foram co-transfectadas com cDNAs codificantes dos alelos Msx1 e Gli3R marcados com sequências C-myc e Flag, respetivamente. Os resultados obtidos posteriormente por Western Blot revelaram que era possível precipitar ambas as proteínas GLI3R e MSX1 utilizando anticorpos direcionados contra as sequências C-myc e Flag dos alelos Msx1 e Gli3R respetivamente, indicando que estas proteínas têm capacidade de interagir uma com a outra nas condições experimentais estabelecidas neste sistema artificial (O. Goupille and B. Robert, unpublished data). Contudo, é importante salientar que neste sistema artificial o nível de expressão destas proteínas não é controlado e pode, portanto, não corresponder aos níveis endógenos a que as células do botão do membro estão sujeitas in vivo. Assim, de modo a contornar este problema, é necessário estabelecer um sistema adequado que permita o estudo in vivo destas interações genéticas que ocorrem durante o desenvolvimento do membro embrionário, que constitui, no fundo, o principal objetivo do trabalho aqui apresentado. Com a finalidade de investigar a relação entre os fatores de transcrição Msx1 e Gli3R in vivo utilizando o botão do membro como modelo experimental, começámos por gerar uma série de estirpes animais transgénicas, contendo construções genéticas que nos permitiriam detetar a existência de interações entre estes fatores de transcrição in vivo. Após o cruzamento destas linhagens transgénicas, gerámos embriões com 11 dias pós-coito heterozigóticos para Prx1Cre/0; Msx1HA-His/+; RosaGli3R-Flag/+; Gli3Flox/+ nos quais realizámos uma série de experiências de interações entre proteínas, incluindo Co-IP e a técnica de Proximity Ligation Assay (PLA) seguida de uma análise estatística quantitativa. Através desta última foi possível demonstrar que os fatores de transcrição Msx1 e Gli3R interagem in vivo tanto nas células mesenquimais do membro anterior como do membro posterior aos 11 dias pós-coito. Por outro lado, outros estudos focados no papel dos genes Msx e de componentes da cascata de sinalização BMP na formação do palato têm vindo a sugerir que estes genes interagem com elementos desta via de sinalização, que não o recetor Bmpr1A, de modo a promover a formação do palato (Liu et al., 2005; Zhang et al., 2002). Paralelamente, em 1998 Liu et al. demonstraram que num sistema in vitro constituído por células COS1 transfectadas com isoformas full-length ou truncadas da proteína Gli3, apenas as proteínas truncadas na sua extremidade carboxílica (estruturalmente semelhantes ao repressor transcricional Gli3R) tinham capacidade de se associar a proteínas Smad endógenas através do seu domínio zinc-finger, levantando assim a possibilidade de que as proteínas Gli poderão também interagir in vivo com esta mesma cascata de sinalização através das proteínas Smad. Com base nestes resultados, decidimos também investigar em mais detalhe o envolvimento destes fatores de transcrição na via de sinalização BMP, testando a sua capacidade de interagir com o complexo proteico PSmad1,5,8, o transdutor de sinal intracelular responsável pela regulação da transcrição de genes-alvo desta via de sinalização. Tirando partido da mesma abordagem experimental, conseguimos demonstrar que ambos os fatores de transcrição Msx1 e Gli3R interagem com este complexo proteico nas células mesenquimais do membro anterior aos 11 dias pós-coito. Após termos verificado que os fatores de transcrição Msx1 e Gli3R interagem um com o outro e que ambos estão envolvidos na cascata de sinalização BMP interagindo com o complexo proteico PSmad1,5,8, estávamos interessados em investigar os processos biológicos que têm lugar no botão do membro que poderiam ser controlados por estes complexos proteicos. Uma vez que já tinha sido demonstrado que mutantes Gli3-/- e Msx1-/-; Msx2-/+ apresentam malformações nos membros provocadas pela não ocorrência de apoptose (Aoto et al., 2002; Lallemand et al., 2009), colocámos imediatamente a hipótese de que o fator de transcrição Msx1, juntamente com Gli3R e com o complexo proteico PSmad1,5,8 poderiam estar envolvidos no controlo da apoptose que tem lugar no botão do membro durante o desenvolvimento embrionário. De forma a investigar esta possibilidade e a confirmar que de facto os genes Msx estão envolvidos neste processo, realizámos uma série de experiências de imunofluorescência contra Caspase3 utilizando embriões Msx1-/-; Msx2-/- com o objetivo de avaliar o padrão de distribuição e intensidade da apoptose presente no botão do membro. Os resultados obtidos indicaram claramente que na ausência de Msx1 e Msx2, há uma diminuição drástica na morte celular programada na região anterior do botão do membro, confirmando assim que de facto estes genes são indispensáveis para a ocorrência de apoptose e, em última instância, para a morfogénese e padronização do botão do membro. Tendo como base estes resultados, juntamente com o facto da via de sinalização BMP ter sido sistematicamente apontada como estando implicada na regulação da apoptose que tem lugar nas células mesenquimais do botão do membro de mamíferos e aves (Guha et al., 2002; Yokouchi et al., 1996; Zou and Niswander, 1996), acrescido ao facto de se ter demonstrado que a ausência de genes Msx e/ou Gli3 resulta no aparecimento de anomalias provocadas pela diminuição e/ou ausência de morte celular programada no botão do membro (Aoto et al., 2002; Lallemand et al., 2009), propomos um modelo em que os fatores de transcrição Msx1 e Gli3R interagem com o complexo proteico PSmad1,5,8 de modo a formar um trímero nuclear transcricional responsável pela indução de genes-alvo da cascata de sinalização BMP diretamente envolvidos no controlo da apoptose. Apesar de ter sido possível demonstrar através da PLA que existem interações entre estas três proteínas no botão do membro in vivo, muitos aspetos relacionados com a sua natureza celular e molecular ficaram ainda por esclarecer. Assim, no futuro é necessário investigar estas interações proteicas em mais detalhe por forma a esclarecer, em primeiro lugar, qual é o papel desempenhado pelo fator de transcrição Msx1 na apoptose mediada através da cascata de sinalização BMP. Em segundo lugar, descobrir quais os domínios e motivos proteicos que permitem a estas proteínas interagirem fisicamente umas com as outras. Em terceiro lugar, tentar perceber de que forma é que estas interações proteicas regulam a expressão de genes-alvo da via de sinalização BMP e quais são as consequências que isso acarreta em termos da morfogénese e padronização do membro. E, finalmente, investigar em mais detalhe de que modo é que a apoptose mediada através da cascata de sinalização BMP é regulada temporal e espacialmente e quais serão os outros fatores de transcrição e/ou cofatores envolvidos nesse processo.
