Author(s):
Santos, Ana Sofia Salvador, 1990- 
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9752
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Timo; Embrião de galinha; Células T; Teses de mestrado - 2013
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 In jaw vertebrates, thymus is a primary hematopoietic organ responsible for T-cell differentiation. The thymus derives from the endoderm of the 3rd and 4th pharyngeal pouches (3/4 PP) in avian. However, in distinct species, the thymus can derive from other PP. Such anterior-posterior (AP) diversity of thymus positional origin has become of great interest to evolutionary developmental biology. The transcription factors Homeobox (Hox) genes are responsible for positional identity during development and are ruled out by a spatially collinear of gene expression along the AP-axis of the embryo and by phenotypic suppression by posterior genes. In this study we aimed to identify a potential Hox-code responsible for the positional identity of the thymus. For that, we first characterized the expression pattern of Hox-genes in the pharyngeal region of chick embryos, by whole-mount in situ hybridization, at stages prior to thymus formation. We observed that PP positional identity could be defined by an orderly expression of Hox genes with HoxA3 and HoxB1 defining the anterior frontiers of the 3 PP and 4PP, respectively. We hypothesised that HoxA3 and HoxB1 may be the potential Hox-code responsible for positional identity of thymic rudiment. To test our hypothesis we intend to ectopically express HoxA3 and HoxB1, in the 2PP and 3PP respectively. To genetically modify the PP endoderm, we already produced a pT2K-HoxA3eGFP construct to be used in the combined system of vectors, “Tol2-mediated gene transfer” and “Tetracycline-dependent conditional expression”. To test the efficiency of this system of vectors we transfected the HEK 293T cell line with the control-vectors and we monitored its efficacy by fluorescence microscopic observation and flow cytometry analysis. Long-term culture of transfected cells showed modest genomic integration of these vectors and “leakage” of the system when modulated by doxycycline. Em vertebrados que apresentam mandíbula, o timo é um órgão especializado do sistema imunitário adaptativo e o principal órgão hematopoiético responsável pela produção e diferenciação de células-T “auto-restritas” e “auto-tolerantes”. A produção destas células-T está dependente da interação entre as suas células percursoras, os timócitos, e as células epiteliais tímicas (CET), células especializadas do nicho tímico. O desenvolvimento do timo é acompanhado pelo desenvolvimento das glândulas paratiróides, pois partilham a mesma origem embrionária, as bolsas faríngicas (BF). Em galinha, foi demonstrado que os domínios presuntivos do timo e das glândulas paratiróides são identificados na endoderme da 3ª e 4ª BF pela expressão dos factores de transcrição Foxn1 e Gcm2, respectivamente. No entanto, entre as diferentes espécies de vertebrados, o timo pode derivar de diferentes bolsas faríngicas. Nos peixes cartilagíneos, considerados o grupo de espécies mais primitivo a desenvolver timo, como por exemplo o tubarão, o timo deriva conjuntamente das 2ª à 6ª BF. No caso dos anfíbios, a origem do timo é a 2ª BF e nos répteis desenvolve-se a partir da 2ª e da 3ª BF. Em aves, o timo deriva das 3ª e 4ª BF e nos mamíferos apenas da 3ª BF. A extraordinária diversidade, ao longo do eixo anterior-posterior (A-P), no número de BF com potencial para o desenvolvimento do timo tornou-se uma questão de grande interesse para a biologia evolutiva e do desenvolvimento e remete para o estudo de mecanismos moleculares conservados evolutivamente, que ocorrem em estadios precoces do desenvolvimento das BF, nomeadamente da 3ª e da 4ª bolsas. Os genes Homeobox (Hox) são factores de transcrição, evolutivamente conservados entre filos e são os genes responsáveis pela especificação do plano corporal, nomeadamente do eixo A-P. Estes genes por sua vez, são governados pelas regras da colinearidade espacial da sua expressão génica ao longo do eixo A-P do embrião e pela prevalência posterior ou supressão fenotípica dos genes posteriores. Diferentes estudos sobre o padrão de expressão dos genes Hox em ratinho e galinha sugerem a existência de um código formado por combinações específicas destes genes que determinam uma região específica do eixo A-P do embrião. De um ponto de vista evolutivo, a existência de um código-Hox a nível das BF, conservado entre vertebrados, poderia explicar a diversidade no número de BF com potencial para o desenvolvimento do timo. Múltiplos estudos em ratinho e galinha demonstraram o papel fundamental de HoxA3 na formação do 3º arco e 3ª bolsa faríngicos e nos seus derivados. Surpreendentemente, o fenótipo da mutação HoxA3 em ratinho é muito semelhante ao fenótipo apresentado por doentes com síndrome de DiGeorge: não apresentam timo nem glândulas paratiróides, apresentam hipoplasia da tiroide e múltiplos defeitos na estrutura dos 3º e 4º arcos faríngicos. Estas evidências sugerem um importante papel deste gene na identidade da bolsa de origem do timo e possivelmente na própria identidade posicional do timo. Neste projecto, o nosso príncipal objectivo foi a identificação de um possível código Hox responsável pela identidade posicional do timo na 3ª e 4ª BF no embrião de galinha. Para tal e com o objectivo de identificar quais os genes Hox expressos na endoderme da 3ª e 4ª BF, começamos por realizar hibridações in situ em embriões de galinha nos estadios E3 e E4, estadios anteriores à formação do timo. Foram caracterizados os padrões de expressão dos genes HoxA2, HoxA3, HoxB1, HoxB2, HoxB3 e HoxB4, alguns dos genes Hox expressos mais anteriormente no embrião. De forma a obtermos informação mais detalhada da expressão destes genes nos tecidos mais internos da região faríngica, os embriões foram processados pós-hibridação para cortes histológicos. Neste estudo foram também desenvolvidas novas sondas para os genes HoxA3, HoxB2 e HoxB4. A análise dos padrões de expressão génica na região faríngica revelou a expressão ordenada de genes HoxA ao longo do eixo A-P. Nomeadamente, observámos a expressão de HoxA2 a partir do 2º arco faríngico (AF) e especificamente na 2ª BF e expressão de HoxA3 a partir do 3º AF e especificamente na 3ª BF. Relativamente à expressão dos genes do grupo HoxB, não se observou uma expressão padronizada ao longo do eixo A-P. O padrão de expressão de HoxB1 foi observado unicamente na porção posterior da endoderme da 4ª BF. No caso dos genes HoxB2, HoxB3 e HoxB4, a sua expressão foi observada no mesênquima da região posterior à 4ª BF. Curiosamente, também foi observada expressão de HoxB4 ao nível da porção posterior da endoderme da 4ª BF. Estes resultados sugerem que a identidade posicional das diferentes BF pode ser definida por uma combinação específica de genes Hox. Em particular, sugerem que os genes HoxA3, HoxB1 e HoxB4 se encontram a definir as fronteiras anteriores da 3ª e 4ª BF. No entanto, estudos em ratinho demonstraram que HoxB4 está apenas envolvido na especificação da região ventral do embrião, sugerindo que este não está envolvido na identidade posicional das BF. Com estes resultados, levantamos assim a hipótese da combinação HoxA3+HoxB1- ser o código responsável pela identidade posicional do timo. Para testar esta hipótese, desenhámos um ensaio funcional in vivo em que a endoderme de diferentes BF é modificada geneticamente para expressar de forma ectópica os genes Hox. Especificamente, o nosso objectivo era sobre-expressar HoxA3 e HoxB1, na 2ª BF e 3ª BF, respectivamente, por forma a modificar a identidade posicional das mesmas. Para modificar geneticamente a endoderme, utilizamos um sistema de vectores que combina a “Transferência génica mediada por Tol2” e a “expressão condicional dependente de tetraciclina” (desenvolvido por Y. Takahashi e colaboradores). Para a utilização deste sistema no nosso trabalho, foram desenhados 2 novos vectores: pT2K-HoxA3eGFP, para a expressão de HoxA3 e pT2K-HoxB1eGFP para a expressão de HoxB1. Durante a realização desta tese, realizámos a construção do primeiro vector, encontrando-se o segundo em construção. Para testar a eficiência do sistema de vectores utilizamos uma linha celular humana, a linha HEK 293T. Esta foi transfectada com o sistema de vectores (controlo), em condições que permitissem avaliar a capacidade de integração genómica e a resposta deste sistema quando modulado por doxiciclina (doxy). A cultura de células transfectadas foi avaliada por observação ao microscópio de fluorescência e analisada por citometria de fluxo. Os resultados obtidos, ao longo de 14 dias, demonstraram uma rápida e drástica redução tanto na percentagem de células a expressar GFP como na intensidade média de fluorescência de GFP, sugerindo uma reduzida capacidade de integração dos vectores deste sistema no genoma. Para avaliar a resposta do sistema quando modulado pela presença/ausência de doxy, as células foram transfectadas na presença de doxy. Células transfectadas e cultivadas na presença de doxy apresentaram, aproximadamente, 20% de células GFP+ após 48h de cultura. Este resultado demostrou que este sistema não bloqueia eficientemente a expressão de GFP, sugerindo a existência de um “leakage” na modulação pela doxy. No entanto, foi observado, que a presença continuada de doxy levou à redução da intensidade média de fluorescência das células GFP+, após 10-14 dias em cultura, sugerindo que este “leakage” é responsável por níveis muito baixos de expressão génica. Foi também observado, que a remoção de doxy às 48h de cultura levou a um aumento da intensidade média de fluorescência das células GFP+. Estes dados sugerem que este sistema de vectores é modulado negativamente pela doxy, pois na sua presença, o sistema bloqueia a expressão de GFP. De futuro, com as construções de vectores finalizadas e as condições de utilização do sistema de vectores aferidas, iremos realizar os ensaios funcionais que permitam avaliar a possível mudança de identidade das bolsas por expressão ectópica dos genes HoxA3 e HoxB1 nas 2ª e 3ª BF, respectivamente. Resumidamente, as endodermes isoladas da 2ª e da 3ª BF serão geneticamente modificadas com os plasmídeos pT2K-HoxA3eGFP e pT2K-HoxB1eGFP (neste sistema de vectores), respectivamente. Serão depois cultivadas in vitro com mesênquima permissivo e posteriormente enxertadas na membrana corioalantóide para testar a formação dum timo (desenvolvimento in ovo). Com este ensaio esperamos mostrar o “ganho-de-potencialidade” da 2ª BF e a “perda-de-potencialidade” da 3ª BF, na formação do timo. A conjugação deste sistema de vectores com o ensaio funcional oferece uma abordagem experimental única para a identificação dum putativo código-Hox responsável pela identidade posicional do timo.
