Autor(es):
Friaes, Ana Isabel de Aquino, 1979- 
Data: 2013
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/9649
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Streptococcus pyogenes; Antigénios; Tipagem molecular; Infecção; Microbiologia; Teses de doutoramento - 2013
Descrição
Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013 Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus, GAS) is one of the most common human pathogens, causing mostly superficial, mild infections of the upper respiratory tract and skin, but also a variety of invasive infections that are characterized by an extremely rapid onset and progression of severe systemic signs, resulting in high morbidity and mortality. Besides characterizing the main GAS lineages causing invasive infections in different world regions, some studies have attempted to identify GAS clones with enhanced virulence that may have prompted the reemergence of invasive GAS disease witnessed by developed countries since the late 1980s. These studies have generated contrasting results, with some reporting a similar clonal composition between the GAS populations causing invasive and non-invasive infections, while others argue for the existence of particularly virulent clones that are overrepresented among invasive isolates. However, many of those studies were limited in the genetic diversity of the GAS collections analyzed and in the typing methodologies used, relying essentially on M/emm typing. With the aim of characterizing the population structure and dynamics of the GAS isolates causing invasive infections in Portugal, a total of 351 isolates collected from normally sterile sites throughout the country between 2000 and 2009 were studied by emm typing, T typing, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) macrorestriction profiling, superantigen (SAg) gene profiling, multilocus sequence typing (MLST), and antimicrobial susceptibility testing. In order to evaluate the presence of GAS clones with enhanced invasive ability and to identify potential genetic markers of invasiveness, the properties of the 160 invasive isolates collected during 2000-2005 in Portugal were compared with those of a collection of 360 isolates associated with pharyngitis, recovered during the same time period. The GAS isolates causing invasive infections in Portugal presented a high genetic diversity, despite the dominance of a PFGE-defined lineage of macrolide-susceptible isolates presenting emm1-T1-ST28 and the SAg genes speA, speG, speJ, and smeZ, which is widely disseminated in developed regions and significantly associated with invasive infections in Portugal and other countries. Another PFGE cluster was significantly overrepresented among invasive isolates in Portugal, when compared with the isolates causing pharyngitis, composed mainly of isolates of emm64-ST164 and carrying the speG and smeZ genes. This cluster, in viii contrast to the emm1-T1-ST28 lineage, has not been frequently identified among invasive isolates in other countries and presented a very low prevalence in the period of 2006-2009 in Portugal. Specific individual characteristics, namely emm1, emm64, and the presence of speA or speJ genes were identified as genetic markers of invasiveness, while emm4, emm75, and the ssa, speL, and speM genes were associated with a decreased ability to cause invasive infections. The overall clonal distribution of the isolates causing invasive GAS infections in Portugal showed significant fluctuations between the two time periods of the study (2000-2005 and 2006-2009), in agreement with recent observations from other developed countries. Interestingly, in spite of an overall decrease in the diversity of the circulating invasive GAS lineages in Portugal, a genetic diversification of some of these lineages was observed. This was reflected by a higher diversity of SAg profiles within these clones, in the period of 2006-2009, due to loss and acquisition of SAg genes, as well as by the occurrence of macrolide-resistant isolates in clones that were previously uniformly susceptible, suggesting a recent acquisition of resistance determinants. Macrolide resistance was significantly lower among the isolates recovered from invasive infections (12%) than among those associated with pharyngitis (21%) (P = 0.016), in contrast to tetracycline resistance, which was higher in the invasive isolates (17% vs 6% in pharyngitis isolates, P < 0.001). Remarkably, among the isolates sharing emm1-T1-ST28 and emm4-T4-ST36, only the PFGE clusters grouping macrolide-susceptible isolates were significantly associated with invasive infection or pharyngitis, respectively, while the macrolide-resistant clones presented a similar distribution among the two infection types. The clonal spread of isolates with reduced fluoroquinolone susceptibility reported in other countries was not observed among invasive infections in Portugal, despite the identification of two isolates with reduced susceptibility and one with high level resistance to levofloxacin. The comparison of the several typing methods used regarding to their concordance and discriminatory power, based on a genetically diverse collection of GAS isolates, confirmed previous findings showing that emm typing is not sufficient for an accurate discrimination of GAS clones, requiring complementation with other typing methods. PFGE was generally the most efficient in predicting the other molecular properties and was the only method capable of discriminating isolates of the same emm type according to macrolide resistance and disease presentation. SAg gene profiling was able to further discriminate ix isolates sharing the same emm type, reflecting a shorter time-scale of genetic evolution than the remaining molecular typing methods. The SAg screening of the isolates was performed by two multiplex polymerase chain reactions (PCR) using as positive control fragments the chromosomal genes speB and speF, which encode a cysteine protease and a deoxyribonuclease, respectively. Following the identification of four isolates lacking one or both of these genes, four distinct deletions of different extensions in the chromosomal region comprising speB, speF and the transcriptional regulator gene rgg were characterized in detail. The studies presented in this thesis provide the first detailed molecular characterization of the GAS isolates causing invasive infections in Portugal, highlighting the prevalence of widely disseminated lineages, but also the local emergence of invasive clones with limited geographic and temporal expansion. The results emphasize the importance of using multiple typing methods in order to achieve an unambiguous discrimination of GAS isolates, and indicate an ongoing evolution of the genetic lineages causing invasive infections in Portugal, associated with horizontal gene transfer mechanisms. The identification of several genetic markers linked to either increased or decreased invasive potential underscores the role of bacterial genetic factors for the outcome of GAS infections. However, the molecular properties of the majority of the isolates causing invasive infections in Portugal reflected the clonal structure presented by the pharyngitis-causing GAS population, suggesting that other, yet unidentified factors must also play an important role in disease presentation. Streptococcus pyogenes (Streptococcus do Grupo A de Lancefield, GAS) é um dos agentes patogénicos mais comuns no ser humano, sendo responsável sobretudo por infecções superficiais ligeiras, mas podendo também causar uma variedade de infecções invasivas que se caracterizam por um aparecimento e progressão extremamente rápidos de manifestações sistémicas graves, resultando em elevados níveis de morbilidade e mortalidade. Para além de procederem à caracterização das principais linhagens de GAS associadas a infecção invasiva em diversas regiões geográficas, alguns estudos procuraram identificar clones de GAS com virulência aumentada, que possam estar na origem do reaparecimento das infecções invasivas registado nos países desenvolvidos desde os finais da década de 1980. Estes estudos originaram resultados contraditórios, alguns dos quais sugerem uma composição clonal semelhante entre populações de GAS associadas a infecções invasivas e não invasivas, enquanto outros evidenciam a existência de clones particularmente virulentos que se encontram sobre-representados nas infecções invasivas. No entanto, muitos destes estudos são limitados ao nível da diversidade genética dos conjuntos de estirpes* analisados, bem como das metodologias de tipagem utilizadas, baseando-se sobretudo na tipagem M/emm. Com o intuito de caracterizar a estrutura e dinâmica da população de GAS causadora de infecções invasivas em Portugal, 351 estirpes isoladas de locais habitualmente estéreis, entre 2000 e 2009, em diversas regiões do país, foram estudadas através de um conjunto alargado de métodos utilizados em estudos epidemiológicos de GAS, nomeadamente tipagem emm, tipagem T, análise dos perfis de macro-restrição do DNA por electroforese em campo pulsado (PFGE, “Pulsed-Field Gel Electrophoresis Profiling”), determinação do perfil de genes de superantigénios (SAgs), “Multilocus Sequence Typing” (MLST) e testes de susceptibilidade a antimicrobianos. De forma a avaliar a presença de clones de GAS com capacidade invasiva aumentada e identificar potenciais marcadores genéticos de invasibilidade, as propriedades das 160 estirpes invasivas isoladas entre 2000 e 2005 foram comparadas com as de um conjunto de 360 estirpes associadas a faringite, obtidas durante o mesmo período, em Portugal. As estirpes de GAS associadas a infecção invasiva em Portugal apresentaram uma elevada diversidade genética, apesar do predomínio de um clone de PFGE constituído por estirpes susceptíveis aos macrólidos, caracterizadas por emm1-T1-ST28 e contendo os genes speA, speG, speJ e smeZ. Este clone encontra-se disseminado a nível mundial e foi significativamente associado a infecção invasiva, tanto em Portugal como noutros países. Identificou-se um outro agrupamento de PFGE significativamente sobre-representado em estirpes invasivas em Portugal, por comparação com as de faringite, constituído principalmente por estirpes de emm64-ST164 contendo os genes speG e smeZ. Este clone, contrariamente à linhagem emm1-T1-ST28, não tem sido identificado com frequência em estirpes invasivas noutros países e apresentou uma prevalência bastante reduzida no período de 2006-2009 em Portugal. Foram identificadas características individuais específicas, nomeadamente emm1, emm64, e a presença dos genes speA ou speJ, como marcadores genéticos de invasibilidade, enquanto os tipos emm4 e emm75, bem como os genes ssa, speL e speM foram associados a uma capacidade diminuída de provocar infecção invasiva. A distribuição global dos clones de estirpes associadas a infecções invasivas em Portugal sofreu flutuações significativas entre os dois períodos do estudo (2000-2005 e 2006-2009), em consonância com observações recentes de outros países desenvolvidos. Apesar de se ter registado uma diminuição global da diversidade de linhagens de GAS responsáveis por infecções invasivas a circular em Portugal, observou-se um aumento da diversidade genética de algumas delas. Este facto traduziu-se por uma maior diversidade de perfis de SAgs nestes clones, no período de 2006-2009, devido a aquisição e perda de genes de SAgs, bem como pelo aparecimento de estirpes resistentes aos macrólidos em clones que no período anterior eram uniformemente susceptíveis, sugerindo uma aquisição recente de determinantes genéticos de resistência. A resistência aos macrólidos foi significativamente mais baixa entre as estirpes isoladas de infecções invasivas (12%) do que entre as de faringite (21%) (P = 0.016), por oposição à resistência à tetraciclina, que foi superior nas estirpes invasivas (17% vs 6% nas estirpes de faringite, P < 0.001). É de salientar que, de entre as estirpes caracterizadas por emm1-T1-ST28 e por emm4-T4-ST36, apenas se identificou associação significativa com infecção invasiva ou faringite, respectivamente, para os clones de PFGE que agruparam as estirpes susceptíveis aos macrólidos, enquanto os clones de estirpes resistentes com as mesmas características moleculares apresentaram uma distribuição semelhante entre os dois tipos de infecção. A expansão clonal de estirpes com susceptibilidade reduzida às fluoroquinolonas que tem sido descrita noutros países não foi observada em infecções invasivas em Portugal, apesar da identificação de duas estirpes com susceptibilidade reduzida e de uma com elevada resistência à levofloxacina. A comparação dos vários métodos de tipagem utilizados no que diz respeito à sua concordância e poder discriminatório, baseada num conjunto de estirpes de GAS com elevada diversidade genética, permitiu confirmar resultados anteriores que demonstravam que a tipagem emm não é suficiente para uma correcta discriminação dos clones de GAS, devendo ser complementada com outros métodos de tipagem. Na generalidade, a análise por PFGE foi o método mais eficiente a prever as restantes propriedades moleculares e foi o único método capaz de discriminar estirpes do mesmo tipo emm de acordo com a resistência aos macrólidos e tipo de infecção. A determinação do perfil de SAgs permitiu discriminar estirpes com o mesmo tipo emm, reflectindo uma escala de tempo evolutivo mais curta do que os restantes métodos de tipagem analisados. A determinação dos perfis de SAgs foi efectuada através de duas reacções de polimerização em cadeia (PCR, “Polymerase Chain Reaction”), utilizando como fragmentos de controlo positivo os genes cromossómicos speB e speF, que codificam, respectivamente, uma protease de cisteínas e uma desoxirribonuclease. Subsequentemente à identificação de quatro estirpes que não apresentavam um ou nenhum destes dois genes, foram caracterizadas quatro delecções de diferentes extensões na região cromossómica que inclui os genes speB, speF e também o gene do regulador transcripcional rgg. Os estudos descritos na presente tese constituem a primeira caracterização molecular detalhada das estirpes de GAS associadas a infecção invasiva em Portugal, salientando a prevalência de linhagens amplamente disseminadas, mas também a emergência local de clones invasivos mais limitados a nível geográfico e temporal. Os resultados sublinham a importância da utilização de múltiplos métodos de tipagem com vista a uma correcta discriminação das estirpes de GAS e sugerem estar em curso a evolução de algumas das linhagens responsáveis por infecções invasivas em Portugal, associada a mecanismos de transferência genética horizontal. A identificação de vários marcadores genéticos indicadores de um potencial invasivo aumentado ou reduzido salienta o papel dos factores genéticos bacterianos no resultado das infecções por GAS. Contudo, as propriedades moleculares da maioria das estirpes isoladas de infecções invasivas em Portugal refletem a composição clonal da subpopulação de GAS associada a faringite, sugerindo que outros factores ainda não identificados poderão também desempenhar um importante papel na manifestação clínica da infecção.
