Autor(es):
Santos, Dulce Cordeiro dos, 1988- 
Data: 2013
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/9450
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Biologia molecular; Silenciamento de genes; Teses de mestrado - 2013
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 O RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo de silenciamento genético desencadeado por estruturas de RNA de cadeia dupla (dsRNA). Este mecanismo apresenta uma importante função antiviral e, devido à sua elevada especificidade, capacidade de silenciamento e potencial efeito sistémico, tem-se demonstrado uma eficaz ferramenta de indução de perda-de-função em investigação. Além disso, este mecanismo tem sido proposto como potencial pesticida para o controlo de pragas agrícolas. A resposta RNAi é muito variável, quer entre espécies, quer dentro da mesma espécie, podendo variar consoante o tecido, estado de desenvolvimento e método de entrega do dsRNA. Contudo, os mecanismos envolvidos têm sido essencialmente estudados em Drosophila melanogaster, que possui uma sensibilidade baixa ao RNAi (sistémico). Por outro lado, o gafanhoto do deserto, Schistocerca gregaria, demonstra uma resposta RNAi de elevada robustez e sensibilidade. Neste contexto, uma vez que esta espécie constitui uma praga voraz e que o RNAi pode contribuir para estratégias seletivas de controlo de pragas agrícolas, o gafanhoto do deserto constitui um organismo muito interessante para a investigação dos mecanismos do RNAi (sistémico). Em S. gregaria, a injeção de dsRNA é um método eficaz para a indução de uma resposta sistémica de interferência mas, por outro lado, a entrega de dsRNA via oral não resulta em silenciamento genético. Estudos realizados no nosso laboratório demonstraram a existência de atividade de degradação de dsRNA no suco do intestino médio do gafanhoto do deserto e identificaram, com base numa dsRNase isolada do suco digestivo de Bombyx mori, quatro dsRNases no transcritoma de S. gregaria (denominadas dsRNase-1, -2, -3 e -4). Desta forma, o primeiro objetivo desta tese consistiu em identificar as nucleases responsáveis pela atividade degradadora de dsRNA no suco do intestino médio nesta espécie. Neste contexto, um perfil de transcrição das dsRNase-1, -2, -3 e -4 foi realizado e, de acordo com os nossos resultados, estas são maioritariamente expressas no intestino médio do gafanhoto do deserto, o que está de acordo com a hipótese destas nucleases desempenharem um papel na degradação do dsRNA no suco digestivo. Para testar esta hipótese, a tecnologia do RNAi foi usada para proceder ao “knockdown” das quatro dsRNases individualmente, através da injeção de dsRNA específico no hemocélio de gafanhotos adultos. Uma forte diminuição transcricional de cada dsRNase foi obtida mas, devido a uma grande similaridade entre as sequências disponíveis, foram também observados efeitos “off-target” nos gafanhotos tratados com dsRNA específico para a dsRNases-1 e -2. Porém, os efeitos “off-target” nunca foram tão fortes como os efeitos de silenciamento específico. Notavelmente, a atividade de degradação de dsRNA observada no intestino médio dos gafanhotos injetados com dsRNA para a dsRNase-2 foi altamente comprometida, o que sugere que a dsRNase-2 contribui fortemente para a degradação do dsRNA no intestino médio de S. gregaria. Contudo, uma vez que neste grupo também se observou uma sub-regulação significativa da dsRNase-1, é ainda possível que uma combinação da dsRNases-1 e -2 seja necessária para a forte atividade de degradação de dsRNA no suco do intestino médio do gafanhoto do deserto. Em contraste, as dsRNases-3 e -4 não parecem contribuir para a degradação do dsRNA no intestino médio. Por outro lado, investigação realizada no nosso grupo revelou a existência de atividade de ligação ao dsRNA na hemolinfa de S. gregaria e foi demonstrado que a apolipoforina-III (ApoLpIII), uma componente da lipoforina, esta envolvida nesta ligação. A lipoforina é um complexo proteico com um importante papel no transporte de lípidos e é constituída pela apolipoforina-I e -II (provenientes do mesmo percursor, ApoLpI/II) e, em determinadas situações fisiológicas, também pela apolipoforina–III. Desta forma, o segundo objetivo desta tese foi investigar se as lipoforinas são responsáveis pela atividade de ligação ao dsRNA na hemolinfa e, dependendo nos resultados obtidos, testar se estes complexos proteicos podem proteger o dsRNA da degradação na hemolinfa (terceiro objetivo). Neste contexto, começámos por realizar um perfil de transcrição da ApoLpI/II e da ApoLpIII, o que indicou que estas são fortemente expressas no corpo gorduroso do gafanhoto do deserto. De seguida, procedemos a um ensaio de ligação ao dsRNA com lipoforinas isoladas da hemolinfa de S. gregaria. A observação de uma alteração da mobilidade em gel indicou que a lipoforina possui, de facto, atividade de ligação ao dsRNA. Seguidamente, para testar se as lipoforinas protegem o dsRNA da degradação, suco do intestino médio e serum de gafanhoto do deserto foram utilizados, separadamente, em ensaios de proteção ex vivo. Os resultados não revelaram proteção do dsRNA pelas lipoforinas em nenhum dos casos. Em quarto lugar, pretendemos avaliar o papel das componentes da lipoforina no RNAi (sistémico). Para tal, testámos a influência da ApoLpI/II e da ApoLpIII no RNAi (sistémico) através de uma abordagem “RNAi em RNAi” in vivo. Esta metodologia consiste em silenciar um gene-teste através da técnica de RNAi e, seguidamente, medir o efeito deste silenciamento na potência da resposta RNAi para um gene-marcador. O “knockdown” transcricional da ApoLpI/II e da ApoLpIII foi bem sucedido, mas a abordagem “RNAi em RNAi” não revelou resultados conclusivos. Quando a ApoLpI/II se encontrava transcricionalmente sub-regulada, a resposta RNAi (sistémica) foi parcialmente comprometida. Contudo, este resultado não foi significativo e um controlo para verificar se o “knockdown” da ApoLpI/II não interfere diretamente com a expressão do gene-marcador não foi realizado. No caso da ApoLpIII, não foi possível observar nenhuma diferença na potência da resposta RNAi (sistémica). Ambas as situações se referem a um “knockdown” e, desta forma, as proteínas podem estar presentes, apesar de em níveis reduzidos. Neste contexto, e considerando que a injeção de quantidades muito reduzidas de dsRNA é suficiente para causar um forte “knockdown” transcricional, os níveis de ApoLpI/II e ApoLpIII presentes podem ser suficientes para se ligar a pequenas quantidades de dsRNA e desempenhar o seu papel. Desta forma, não foi possível concluir acerca do papel dos componentes da lipoforina no RNAi (sistémico) do gafanhoto do deserto. De seguida, considerando um possível mecanismo de “uptake” de dsRNA, o quinto objetivo desta tese foi avaliar o envolvimento da endocitose dependente de clatrina no RNAi (sistémico), após injeção de dsRNA na cavidade abdominal de S. gregaria. Neste contexto, utilizámos uma abordagem “RNAi em RNAi” para testar dois genes envolvidos em distintos passos da endocitose dependente de clatrina, nomeadamente clath (do inglês clathrin heavy chain) e vha16 (do inglês vacuolar H-ATPase 16). Estes dois genes estão envolvidos no “uptake” de dsRNA exógeno na mosca da fruta e, de forma similar ao que foi observado em Drosophila, o silenciamento individual destes genes comprometeu a resposta RNAi (sistémica) no gafanhoto do deserto, o que indica que a endocitose dependente de clatrina está envolvida no processo (sistémico) de RNAi, provavelmente no mecanismo de “uptake” de dsRNA. Finalmente, o sexto objetivo deste trabalho foi investigar se os recetores scavenger (RS) desempenham um papel no RNAi (sistémico) do gafanhoto do deserto. Para tal, avaliámos o efeito da inibição farmacológica dos RSs, com conhecidos inibidores gerais desta família de recetores, no RNAi (sistémico) in vivo. De acordo com os nossos resultados, quando os RSs estavam inibidos, a resposta RNAi (sistémica) foi comprometida, o que indica que estes receptores estão envolvidos no mecanismo de RNAi (sistémico) do gafanhoto do deserto, provavelmente no “uptake” endocítico de dsRNA, de uma forma semelhante ao que acontece em Drosophila. Em suma, o presente estudo reporta a identificação de uma nuclease que contribui para a degradação do dsRNA no suco do intestino médio do gafanhoto do deserto, denominada dsRNase-2, e a identificação da lipoforina como efetora da atividade de ligação ao dsRNA na hemolinfa. Adicionalmente, o mecanismo endocítico dependente de clatrina e mediado por RSs é proposto como um processo de importação celular de dsRNA na mesma espécie. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão do mecanismo de RNAi sistémico no gafanhoto do deserto. RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism triggered by double-stranded RNA (dsRNA) structures. Among other biological activities, this pathway exerts an important antiviral function. Notably, due to its strong silencing potency, specificity and potential systemic (sys) effect, RNAi has proven to be very effective as a loss-of-function tool in bioresearch and, in addition, this pathway has potential to contribute to the control of insect crop pests. However, the interference response displays a strong inter-species variation and, even within the same organism, it can vary between different tissues, developmental stages or even according to the dsRNA delivery method. The desert locust, Schistocerca gregaria, constitutes an interesting organism to study these matters. This species displays a very robust and sensitive (sys)RNAi response upon injection of dsRNA in the hemocoel but does not respond to dsRNA delivered by feeding. In addition, the desert locust constitutes an agricultural pest of concern, making it a potential target for RNAi-based pest control. Previous work from our lab demonstrated dsRNase activity in the midgut juice and in the hemolymph, and four dsRNases were identified in the transcriptome of the desert locust. Moreover, additional dsRNA-binding activity was found in the hemolymph and Apolipophorin-III was demonstrated to be involved. The current study reports on the identification of a nuclease, named dsRNase-2, that contributes to the degradation of dsRNA in the midgut juice of the desert locust and on the identification of lipophorins as effectors of the dsRNA-binding activity in the hemolymph of S. gregaria. Furthermore, we identified Clathrin-dependent scavenger receptors-mediated endocytosis as a mechanism for cellular uptake of dsRNA in vivo. Taken together, the present results contribute to a better understanding of the sysRNAi mechanism in the desert locust.
