Autor(es):
Gilberto, Samuel Filipe da Graça 
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/8778
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Polineuropatia amiloidótica familiar; Transtirretina; Glicação; Fibrinogénio; Espectrometria de massa; Teses de mestrado - 2011
Descrição
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011 A Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF) é uma doença neurodegenerativa hereditária caracterizada pela deposição de transtirretina (TTR) no sistema nervoso periférico. Como consequência, verifica-se perda de sensibilidade nos membros dos pacientes, seguida de atrofia muscular, fraqueza e morte 10 a 20 anos após o início dos sintomas. O desenvolvimento desta doença requer a presença de TTR mutada, conhecendo-se mais de 80 mutações que levam à formação de fibras amilóides. Como mecanismo para a formação destes agregados, estudos in vitro apontam para uma destabilização dos tetrâmeros que contêm variantes da TTR, resultando na formação de monómeros amiloidogénicos. No entanto, existem diversas observações que sugerem um mecanismo mais complexo in vivo, envolvendo factores não genéticos. Por exemplo, indivíduos que possuem a mesma mutação no gene da TTR, incluindo gémeos monozigóticos, não mostram o início da sintomatologia com a mesma idade. Existem ainda diferenças geográficas no que toca à idade de desenvolvimento dos sintomas e na própria morfologia dos agregados. Ao contrário do expectável, indivíduos homozigóticos para genes de TTR mutada não apresentam uma forma mais agressiva da doença. Com um papel central nestas diferenças fenotípicas poderão constar mecanismos de defesa, como é o caso do conjunto de proteínas denominadas chaperones moleculares. Seguindo esta hipótese, observou-se recentemente uma interacção da TTR com o chaperone extracelular fibrinogénio. Curiosamente, o fibrinogénio encontra-se selectivamente modificado em pacientes PAF. Esta modificação pós-traducional, denominada glicação, foi descrita como estando envolvida noutras doenças de natureza semelhante à PAF, como é o caso da doença de Alzheimer ou de Parkinson. Neste trabalho, investigou-se o efeito do fibrinogénio e da glicação na amiloidogénese da TTR. Verificou-se que o fibrinogénio tem a capacidade de prevenir a sua agregação, atingindo-se a actividade máxima numa proporção molar fibrinogénio:TTR de 1:20, sugerindo uma relevância desta interacção in vivo, já que neste caso esta proporção é aproximadamente 1:2. Adicionalmente, observou-se que a glicação do fibrinogénio leva a uma abolição da referida função. Paralelamente, foi realizado um mapeamento dos locais modificados do fibrinogénio com vista a estabelecer a correlação entre os locais modificados e a perda de função deste. Desta forma, foi estabelecido um método optimizado para realizar este mapeamento por espectrometria de massa, tendo-se identificado um total de 60 locais modificados nas três cadeias do fibrinogénio, α, β e γ, com uma cobertura de sequência média de 82%. Familial Amyloidotic Polyneuropathy (FAP) is an hereditary neurodegenerative disease characterized by the deposition of transthyretin (TTR) in the peripheral nervous system. As a consequence, sensibility loss in the patients’ arms and legs takes place, followed by muscle atrophy and death after 10 to 20 years of the disease onset. The development of this disease requires the presence of a mutated variant of TTR, being described more than 80 mutations that result in amyloid fiber formation. As a mechanism for TTR aggregation, in vitro studies suggest that in these patients TTR tetramer (its native form) is destabilized, resulting in the formation of amyloidogenic monomers. However, several observations suggest a more complex mechanism in vivo, with the implication of non-genetic factors. For instance, patients that share the same mutation in the TTR gene, including monozygous twins, do not show the same disease onset age. There are also geographical differences when it comes to the aggregates’ morphology and also the disease onset age. Opposite from the expected, homozygous individuals to mutated TTR genes do not show a more aggressive form of the disease. With a central role in these phenotypic differences may be defense mechanisms, such as molecular chaperones. Following this hypothesis, recently an interaction between TTR and the extracellular chaperone fibrinogen was described. Surprisingly, fibrinogen is selectively modified in FAP patients. This post-translational modification, termed glycation, was previously described as being involved in other conformational diseases, such as Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. In this work, the effect of fibrinogen and glycation in TTR amyloidogenesis was studied by monitoring the aggregation process using spectroscopic methods. It was observed that fibrinogen has the ability to prevent its aggregation, achieving its maximum activity in a molar ratio of 1:20 (fibrinogen:TTR), suggesting a relevance of this interaction in vivo, as in this case the ratio fibrinogen:TTR is approximately 1:2. Moreover, it was observed that fibrinogen glycation abolishes its chaperone function. Additionally, the glycation sites in fibrinogen were mapped, in order to correlate those sites with the loss of fibrinogen’s chaperone function. Therefore, here is also established an optimized method to perform such mapping using mass spectrometry, having been identified a total of 60 modified sites in the three fibrinogen chains, α, β e γ, with an average sequence coverage of 82%.
