Role of ubiquitin ligases in pathophysiology of cystic fibrosis

• Author(s): Canato, Sara Inês de Ascensão Tavares, 1989-
• Date: 2012
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/8404
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biologia molecular; Fibrose quística; Mutação; Ubiquitina; Teses de mestrado - 2012
• Document Type: Master Thesis
• Language: English
• Advisor(s): Clarke, Luka A.; Telhada, Maria Margarida Blasques, 1951-

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 Cystic Fibrosis (CF) is the most common lethal monogenic autosomal recessive disease in the Caucasian population and is caused by dysfunction of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) protein which is located at the apical membrane of epithelial cells. F508del is the most predominant disease-causing mutation. CF disease is characterized by an aggressive inflammatory response and chronic infection in the airway. E3 ubiquitin ligases are negative regulators of the TGF-β signaling pathway, which has important anti-inflammatory properties and is dysregulated in CF. Studies have led us to hypothesize that dysregulation of these negative regulators of TGF-β might be partly responsible for the pro-inflammatory phenotype of CF. In an attempt to understand the role of E3 ubiquitin ligases in CF, we focused here on studying the expression of SMURF1 and SMURF2 and NEDD4L in CFBE41º- cells expressing wt-CFTR and F508del-CFTR. Under basal conditions our results demonstrated that the F508del mutation is not sufficient to induce a significant differential expression of E3 ubiquitin ligases. Application of TGF-β and TNF-α at the cell surface of unpolarized CFBE cells proved insufficient to mimic the inflammatory status observed in CF patients and to study the expression of E3 ubiquitin ligases under inflammatory stimuli. We therefore performed further experiments in polarized CFBE cells. In this system, TGF-β and TNF-α increased the expression of SMURF2 in cells expressing F508del-CFTR. TNF-α also increased the expression of NEDD4L in the F508del-CFTR cell line. These results may suggest an attenuation of the TGF-β signal that may be partly responsible for increasing pro-inflammatory signalling in CF. Our results demonstrated that bacterial infection, cell polarization and CFTR genotype may each be partly responsible for alterations in E3 ubiquitin ligase expression that may contribute to inflammation in the CF airway. A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população Caucasiana, causada por uma função anormal da proteína CFTR (do inglês, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), localizada na membrana apical de células epiteliais. F508del consiste na mutação causadora da doença mais predominante. A FQ é caracterizada por uma resposta inflamatória agressiva e infeção crónica das vias respiratórias. A via de sinalização TGF-β, envolvida na resposta anti-inflamatória é regulada negativamente por E3 ubiquitina ligases e parece estar desregulada na FQ. Desta forma, a nossa hipótese é de que uma desregulação destes reguladores negativos do TGF-β possa contribuir para o fenótipo inflamatório verificado na FQ. Com o objetivo final de clarificar o papel das E3 ubiquitina ligases na FQ, estudamos a expressão de SMURF1, SMURF2 e NEDD4L em células CFBE41º- que expressam wt-CFTR e F508del-CFTR. Com base nesta análise, a mutação F508del não demonstrou ser suficiente para induzir um padrão diferencial da expressão das E3 ubiquitina ligases. A exposição do TGF-β e TNF-α na superfície de células CFBE não polarizadas demonstrou ser insuficiente para mimetizar o perfil inflamatório observado em pacientes de FQ e para o estudo da expressão das E3 ubiquitina ligases sobre condições de inflamação. Desta forma, começamos por realizar as experiências em células CFBE polarizadas. Neste sistema a linha celular F508del-CFTR quando tratada com TGF-β e TNF-α demonstrou aumentar os níveis de expressão de SMURF2. O mesmo foi verificado para NEDD4L em resposta ao TNF-α. Estes resultados sugerem uma atenuação da via de sinalização TGF-β que pode ser parcialmente responsável pelo aumento da sinalização pro-inflamatória na FQ. Por último, os nossos resultados demonstram que a infeção bacteriana, a polarização celular e o genótipo CFTR podem ser parcialmente responsáveis pela alteração da expressão das E3 ubiquitina ligases, contribuindo para o fenótipo inflamatório da FQ.