Autor(es):
Tavares, Andreia Filipa Campos, 1989- 
Data: 2012
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/8020
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Virulência; Burkholderia cepacia; Resistência a antibióticos; Fibrose quística; Teses de mestrado - 2012
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 O género Burkholderia é constituído por um grupo de bactérias gram-negativas que apresentam uma elevada diversidade metabólica e que podem ser encontradas em diversos nichos ecológicos tais como o solo e a água, em associação com plantas ou como agentes infeciosos de animais e humanos. Estudos fenotípicos e genotípicos mostraram que algumas destas bactérias apresentavam uma elevada semelhança entre si e foram portanto agrupadas num complexo denominado “Burkholderia cepacia complex” (Bcc). Apesar das bactérias deste complexo serem praticamente inofensivas para indivíduos saudáveis podem infetar pacientes com doenças pulmonares crónicas como a fibrose quística, bem como indivíduos com o sistema imunitário debilitado. A fibrose quística é causada por mutações no gene codificante de uma proteína transportadora do ião cloreto, conduzindo a uma desregulação da produção de muco nos pulmões, a uma maior dificuldade na sua remoção e, consequentemente, a uma maior probabilidade de serem colonizados por microrganismos patogénicos e patogénicos oportunistas. A presença nos pulmões dos pacientes com fibrose quística de bactérias do complexo Bcc multi-resistentes a antibióticos contribui para o estabelecimento de infeções pulmonares crónicas com declínio da função pulmonar que, nos casos mais severos, podem resultar em septicémias e muitas vezes na morte do paciente. A patogenicidade das bactérias do complexo Bcc está relacionada com diversos fatores de virulência, entre os quais o exopolissacárido (EPS) cepaciano. O cepaciano é comumente produzido dentro do género Burkholderia e confere às bactérias um morfotipo mucóide. As funções do EPS variam consoante o organismo podendo estar relacionadas com a patogenicidade da bactéria e com a sua capacidade de adaptação a diferentes ambientes. Durante as infeções prolongadas com bactérias do complexo Bcc pode acontecer uma variação de morfotipo que se caracteriza maioritariamente pela conversão de células mucóides em não-mucóides e que se pensa ser bastante importante para a virulência e adaptação destas ao ambiente pulmonar. Trabalhos anteriores compararam dois isolados clonais da espécie B. multivorans isolados sequencialmente de um paciente com fibrose quística em que o primeiro é mucóide e o segundo é não-mucóide. A caracterização desses dois isolados permitiu observar que as células mucóides e não-mucóides apresentaram diferenças fenotípicas e de expressão génica relacionadas com a motilidade, a formação de biofilmes e a resistência aos antibióticos. O isolado não-mucóide revelou-se também menos virulento do que o isolado mucóide quando se usaram larvas do insecto Galleria mellonella como modelo de infeção. Foi ainda observado que o isolado mucóide tinha a capacidade de originar variantes nãomucóides quando era exposto a diversas condições de stress, incluindo a limitação de nutrientes, a presença de antibióticos, a elevada concentração de sal e de compostos indutores de stress oxidativo, a temperaturas sub- e supra-ótimas, entre outros. Surgiu então a hipótese desta possível variação de morfotipo também ocorrer noutras espécies de Burkolderia pertencentes ou não ao complexo Bcc e provenientes de diferentes nichos ecológicos. Neste trabalho estudou-se então a variação do morfotipo mucóide a não-mucóide de diferentes espécies do género Burkholderia quando estas são sujeitas a limitação de nutrientes e à presença do antibiótico ciprofloxacina. Foram estudadas 16 estirpes de Burkholderia incluindo 9 isolados clínicos pertencentes ao complexo Bcc (B. multivorans D2095; B. cepacia IST408; B. cenocepacia J415; B. stabilis LMG18888; B. vietnamiensis PC259; B. ambifaria CEP0958; B. dolosa CEP0743; e B. anthina FC0974 e FC0967), 5 isolados ambientais também pertencentes ao complexo Bcc (B. multivorans ATCC 17616; B. cepacia ATCC 17759; B. stabilis LMG14086; B. ambifaria AMMD; e B. anthina J2552) e dois isolados ambientais não pertencentes ao complexo Bcc (B. phymatum STM815 e B. xenovorans LB400). Observou-se que tanto as estirpes clínicas como as ambientais do complexo Bcc ou não-Bcc tinham a capacidade de originar variantes não-mucóides em resposta às condições de stress testadas. A infeção de G. mellonella com as estirpes mucóides e respetivas variantes não-mucóides revelou que algumas destas variantes apresentaram uma virulência atenuada relativamente aos respetivos isolados mucosos, enquanto outras mantiveram um grau de virulência semelhante. Do ponto de vista da caracterização fenotípica compararam-se células mucóides com as variantes não-mucóides obtidas a partir da incubação com limitação de nutrientes de quatro estirpes pertencentes a três espécies do complexo Bcc. A comparação englobou a motilidade “swimming” e “swarming”, a formação de biofilmes e a produção de sideróforos. Avaliou-se também a suscetibilidade ao detergente SDS e compararam-se os padrões de LPS, para estudar possíveis alterações membranares. Foi ainda estudada a resistência a agentes causadores de stress oxidativo (hidroperóxido de cumeno e peróxido de hidrogénio) e a antimicrobianos das famílias dos beta-lactâmicos (piperacilina/tazobactam, ceftazidima, imipenemo, aztreonam), aminoglicósidos (amicacina) e quinolonas (ciprofloxacina). No geral a motilidade “swimming” e a formação de biofilmes apresentou-se sempre alterada entre as células mucóides e não-mucóides apesar de não ser possível estabelecer nenhuma tendência. Por outro lado, algumas variantes não-mucóides apresentaram uma maior produção de sideróforos e maior suscetibilidade aos antibióticos quando comparadas com as células mucóides. Com o objetivo de identificar os possíveis mecanismos que conduzem à variação de morfotipo, analisou-se a expressão génica de células mucóides e não-mucóides da estirpe B. multivorans ATCC17616 através de uma experiência de microarrays onde foram comparados os respetivos transcritos. Os resultados mostraram uma diminuição da expressão de genes codificantes de proteínas do sistema de secreção de tipo VI nas variantes não-mucóides, o que pode estar relacionado com uma diminuição da virulência. Os genes codificantes de proteínas constituintes das fimbrias estavam também sub-expressos nas células não-mucóides, enquanto os genes codificantes de proteínas envolvidas na síntese flagelar e na quimiotaxia tinham a sua expressão aumentada. Estes resultados estão em concordância com o aumento da motilidade “swimming” e a diminuição da formação de biofilmes observadas nas células nãomucóides da estirpe B. multivorans ATCC17616. No conjunto de dados de expressão génica observaram-se também alterações na expressão de genes codificantes de vários reguladores de transcrição e de proteínas envolvidas na transdução de sinal. Entre os possíveis reguladores de transcrição inclui-se o gene Bmul_2557 que codifica uma proteína da família LysR. Pensa-se que esta família de reguladores possa estar envolvida em processos celulares como a resistência a antibióticos e a síntese de fatores de virulência. Iniciou-se então uma estratégia de clonagem para eliminar esse gene do genoma da estirpe B. multivorans ATCC17616. Esta estratégia consistiu na amplificação das regiões a montante e a jusante do gene e na sua introdução num vector de clonagem não replicativo para Burkholderia, juntamente com uma cassete que confere resistência a trimetoprim, a qual irá substituir o gene-alvo após dupla recombinação do plasmídeo com o genoma. A obtenção deste mutante é crucial para entender o papel deste regulador de Burkholderia na conversão de células mucóides em não-mucóides. Em conclusão, a variação de morfotipo em espécies do complexo Bcc poderá estar relacionada com alterações fenotípicas e de expressão génica que parecem ser induzidas por exposição das células mucóides a diferentes stresses. A variação de morfotipo é um fenómeno relevante no decorrer das infeções crónicas com bactérias do complexo Bcc em doentes com fibrose quística e a compreensão dos possíveis mecanismos celulares por detrás deste processo representa uma área-chave para estudos futuros. The genus Burkholderia comprises a group of metabolically diverse gram-negative β- proteobacteria that can colonize a wide variety of environments including soil, water, plants, animals and humans. Particularly, bacteria from Burkholderia cepacia complex (Bcc) are well-known opportunistic pathogens infecting cystic fibrosis (CF) and immunocompromised patients. Since CF is caused by mutations in a gene encoding a chloride channel, thus affecting mucus clearance in lungs, infection with antibiotic multi-resistant Bcc bacteria can lead to chronic lung inflammation and in some cases septicemia. Bcc pathogenicity is related to several virulence factors, including the exopolysaccharide (EPS) cepacian which is also a common feature within the genus Burkholderia conferring these bacteria a mucoid phenotype. Mucoid-to-nonmucoid conversion occurs in Bcc long-term infections of CF patients’ airways and it is thought to be highly important in bacterial virulence and adaptation. This study assessed mucoid-to-nonmucoid morphotype variation of different Burkholderia species upon nutrient starvation and ciprofloxacin treatment. It was shown that clinical and environmental Bcc and non-Bcc mucoid strains could originate nonmucoid variants in response to the stress conditions tested. Several of these nonmucoid variants had an attenuated virulence in Galleria mellonella model of infection, while others remained similar to the mucoid parental strains. Phenotypic characterization of mucoid isolates and nonmucoid variants obtained under nutrient starvation was performed. In general, swimming motility and biofilm formation did always differ between mucoid and nonmucoid cells although no tendency was established. On the other hand, some nonmucoid variants showed higher siderophore production and antibiotic susceptibility when compared to the mucoid isolates. Also, mucoid and nonmucoid cells evidenced differences in their gene expression profile, as microarray analysis revealed the altered expression of genes encoding type VI secretion system proteins, fimbrial proteins and proteins involved in flagellar biosynthesis and chemotaxis. Understanding morphotype variation signals and mechanisms represents a key area for future studies.
